香菇多糖抑制肝癌细胞HepG2增殖的作用及其可能机制*

李永格

肝癌是一种常见的消化系统恶性肿瘤，在我国发病率非常高，居所有恶性肿瘤的第2位。肝癌的治疗多通过手术切除、肝脏移植以及化疗等综合疗法，虽然取得了一定进展但预后还是很差，导致其5年生存率不足5%[1，2]。中草药在防治肝癌复发、转移，延长生存期方面具有明显优势。香菇多糖(Lentinan，LNT)是从香菇分离出来的最有效的活性物质，有研究表明其对肝癌细胞有明显的直接抑制作用[3]，但具体机制不清。本课题拟通过不同浓度LNT体外作用于HepG2肝癌细胞系，观察肝癌细胞增殖变化；western-blot检测轴突导向蛋白4C(Sema4C)和G蛋白偶联受体激酶相互作用蛋白1(GIT1)表达，分析其作用的可能机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 细胞株人肝癌细胞系HepG2购自中国科学院细胞库。

1.1.2 药品及试剂LNT购自武汉胜天科技有限公司，(批号：1541023)；四甲基偶氮唑盐(MTT)购自美国Sigma公司；10%胎牛血清；DMEM培养基(美国Invitrogen公司)；抗体(武汉博士德)；其他试剂均为国产分析纯或化学纯。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养人肝癌细胞系HepG2采用10%胎牛血清、100 U/ml青霉素和100 U/ml链霉素的高糖DMEM培养基作常规培养，其中培养温度保持37 ℃、CO2含量5%，取生长良好并处于对数生长期的细胞用于下述实验。

1.2.2 MTT法检测LNT对细胞增殖抑制率的影响LNT采用完全培养基配置成6.25、12.5、25、50、100 μg/ml浓度。根据不同浓度LNT将肝癌细胞分为以下几组：①对照组：完全培养基作用5 h；②6.25 μg/ml LNT组：完全培养基联合6.25 μg/ml LNT作用5 h；③12.5 μg/ml LNT组：完全培养基联合12.5 μg/ml LNT作用5 h；④25 μg/ml LNT组：完全培养基联合25 μg/ml LNT作用5 h；⑤50 μg/ml LNT组：完全培养基联合50 μg/ml LNT作用5 h；⑥100 μg/ml LNT组：完全培养基联合100 μg/ml LNT作用5 h。将细胞按每孔5×105个接种于96孔板中，各组分别设置5个重复孔，加入不同浓度LNT处理5 h后洗去上清液，然后加入完全培养基，向每孔中加入20 μl MTT溶液(浓度为5 mg/ml，用PBS配)，37 ℃培养4 h后吸去上清，加入200 μl DMSO溶液，振荡20 min，使细胞充分溶解，在OD 490 nm处通过酶标仪检测其吸光值并记录。参照上述方法，每隔24 h检测1次细胞增殖情况，共计3次。

1.2.3 western-blot检测GIT1蛋白、Sema4C蛋白在肝癌细胞株中表达根据MTT结果选取100 μg/ml LNT组肝癌细胞与对照组细胞进行western-blot实验。参照试剂盒说明书裂解细胞，提取总蛋白并进行蛋白定量。灌制10%SDS-PAGE凝胶，每孔上样30 μg，250 V转移至聚偏二氟乙烯膜，于37 °C置5%脱脂奶粉封闭液中封闭1 h。滴加一抗，4 °C孵育过夜，37 °C下与HRP标记的二抗孵育1 h，洗涤后ECL曝光。同样的方法对β-actin进行检测并作为内参对照。所得图像用凝胶成像系统进行分析，以目的基因灰度值/内参β-actin灰度值半定量计算蛋白含量。

2 结果

2.1 不同浓度LNT对HepG2细胞增殖影响不同浓度LNT对HepG2细胞增殖都有明显抑制作用且表现为量效、时间依赖性，100 μg/ml LNT作用48 h后，细胞生长出现半抑制，故选择100 μg/ml LNT作用48 h来进行后续研究。见表2。

表1 不同浓度LNT对HepG2细胞的抑制作用 (例，

2.2 western-blot检测LNT作用后HepG2细胞Sema4C、GIT1蛋白表达应用western-blot检测100 μg/ml LNT对HepG2细胞Sema4C蛋白、GIT1蛋白表达的影响，结果显示：100 μg/ml LNT组HepG2细胞Sema4C蛋白、GIT1蛋白相对表达量明显低于对照组(P<0.05)，提示100 μg/ml LNT下调HepG2细胞Sema4C蛋白与GIT1蛋白表达。见表2、图1、图2。

图1 GIT1蛋白表达电泳图

图2 Sema4C蛋白表达电泳图

表2 Sema4C、GIT1蛋白相对表达量

3 讨论

多糖是构成生物体的重要组成部分，具有增强免疫、抗肿瘤、抗氧化、抗衰老等作用[4，5]，尤其是抗肿瘤的作用成为现在研究的热点。目前关于多糖抗肿瘤的作用机制还不清楚，多数研究集中在免疫调节方面。本实验室前期体外实验研究发现LNT能够抑制肝癌细胞的生物学行为[6，7]，说明LNT抗肿瘤作用可能通过其他途径产生。本实验通过MTT法检测肝癌细胞增殖，发现不同浓度LNT对Huh7.5.1细胞增殖有明显抑制作用且表现为量效、时间依赖性，与前期研究结果相符。

Sema4C为SemaⅣ亚族一员，有报道表明常见恶性肿瘤乳腺癌、子宫内膜癌和前列腺癌组织和细胞水平上均见Sema4C较强表达，且肿瘤细胞转移潜能不同，Sema4C蛋白表达的强弱是有差别的[8]。因此，推测Sema4C在人类恶性肿瘤的表达可能具有普遍意义，并且与恶性肿瘤的侵袭和转移密切相关。G蛋白偶联受体激酶相互作用蛋白1(G protein coupled receptor kinase interacting protein1，GIT1)为GIT家族分子，被N-α-乙酰转移酶10(N-α-acetyltransferase10，NAA10)干扰作用后，抑制肿瘤的转移[9]，提示GIT1蛋白可能是肿瘤转移的促进因子。通过western-blot研究发现LNT组肝癌细胞Sema4C蛋白和GIT1蛋白表达明显低于对照组(P<0.05)，说明LNT下调肝癌细胞Sema4C蛋白和GIT1蛋白表达。

综上所述，LNT抑制肝癌细胞增殖，其机制可能通过下调SEMA4C蛋白和GIT1蛋白表达来发挥作用，为LNT治疗肝癌作用机制提供新思路。