一例半番鸭感染鸭瘟的病原分离鉴定及病理组织学观察

张 瑞，刘荣昌，陈长福，黄 瑜 ，程龙飞，傅光华，施少华，陈红梅，万春和，傅秋玲

（1. 福建农林大学动物科学学院（蜂学学院），福建 福州 350002；2. 福建省农业科学院畜牧兽医研究所/福建省禽病防治重点实验室，福建 福州 350013；3. 福建省龙岩市动物疫病预防控制中心 福建 龙岩 364000）

0 引言

【研究意义】鸭瘟（Duck plague，DP），又称鸭病毒性肠炎（Duck virus enteritis，DVE），是鸭、鹅和其他雁形目禽类的一种烈性传染病，其病原为鸭瘟病毒（Duck plague virus，DPV）[1]。DPV属于疱疹病毒科α疱疹病毒亚科马立克病毒属鸭甲疱疹病毒1型成员，基因组为双股线状DNA，大小约160 kb。DPV基因组结构为UL-IRS-US-TRS，主要分为长独特区（UL）、两端的内部重复序列（IRS）、短独特区（US）和末端重复序列（TRS），共包含约78个开放阅读框（ORFs）[2]。DPV感染会引起鸭实质器官局灶性坏死并增加血管通透性，从而导致组织器官、淋巴和消化道大量出血[3]。临床上，患病鸭主要表现为体温升高、食欲减退、下痢、眼睑水肿、流泪等症状，发病率和病死率可高达100%[4]。目前，鸭瘟仍是危害养鸭业的严重传染病之一。【前人研究进展】1923年，Baudet等首次在荷兰的患病鸭群中发现鸭瘟病毒，随后全球多个国家和地区陆续报道了此病的发生[1]。国内，黄引贤等于1957年在广州首次报道了鸭瘟病例[5]。随着鸭瘟疫苗的研制与应用，该病曾得到了有效控制。姜甜甜等[6]报道了2个免疫过鸭瘟病毒疫苗的种鸭群发病，研究发现感染该场的鸭瘟病毒主要囊膜蛋白并未发生变异。2015年，福州的2个鸭场突发疫病，病死率高达93%，刘荣昌等[7]对此展开调查研究，确定其为DPV感染所致。傅光华等[8]从2016—2017年福建省部分地区鸭瘟疑似病例中分离到24株鸭瘟病毒，经过序列测定分析发现与我国DPV参考强毒株相比已出现不同程度的变异。【本研究切入点】2020年8月，福建省福州地区某半番鸭养殖场发生疫情。该场共饲养半番鸭2 000羽，于200日龄左右开始发病，发病1W后其总发病率约为65%，病死率高达90%以上。感染后耐过鸭皮肤表面可见大量出血，严重影响肉鸭的屠宰和上市。该场发病期间使用多种药物治疗无效，遂送于本研究室就诊。【拟解决的关键问题】为明确其病因，分别采集病发病鸭心脏、肝脏、脾脏、胰腺、肾脏、皮肤等组织进行鸭常见病原检测、病毒分离鉴定、基因序列测定分析及病理组织学观察，以期为该病的诊断及防控提供科 学依据。

1 材料方法

1.1 主要试剂

9日龄番鸭胚购自莆田温氏家禽有限公司；EasyPure®Viral DNA/RNA Kit、EasyS-cript®One-Step RT-PCR SuperMix和2×Easy Taq PCR Super Mix购自Transgen公司；DNA分子量标准DL2000购自TaKaRa公司；胰蛋白胨大豆琼脂（Tryptic Soy Agar，TSA）购自Dfico公司；Todd Hewitt Broth购自OXOID公司；高速离心机为Gene公司产品；PCR仪、电泳仪和凝胶 成像系统Versa Doc 2000为Bio-Rad公司产品。

1.2 引物设计与合成

参照文献[9]，合成常见鸭病毒性疾病（禽流感病毒、新城疫病毒、鸭瘟病毒、禽坦布苏病毒、鸭甲肝病毒、禽坦布苏病毒、水禽细小病毒、鸭呼肠孤病毒、鸭3型腺病毒、禽4型腺病毒、鸭星状病毒、鸭圆环病毒）检测引物。参照文献[10]，合成UL2基因引物UL2F/UL2R，用于扩增鸭瘟病毒的UL2基因。以上引物均由福州铂尚生物技术（上海）有 限公司合成。

1.3 病料处理

无菌采集病死鸭心脏、肝脏、脾脏、肾脏、法氏囊和皮肤等组织，一部分用于鸭常见病毒（RT-）PCR检测和病原分离，另一部分用于细菌分离鉴定。同时采集发病鸭心、肝、脾、肺、肾、皮肤等组 织，固定于10%福尔马林，用于病理组织学观察。

1.4 细菌分离

无菌采集发病鸭的脑及肝脏组织，将肝脏和脑组织划线无菌接种于不同培养基平板（麦康凯琼脂平板、鲜血琼脂平板和普通琼脂平板）上，37 ℃恒温 培养24～48 h，观察细菌生长情况。

1.5 （RT）PCR检测

按北京全式金生物技术有限公司Easy Pure Viral DNA/RNA Kit试剂盒操作，提取病毒核酸。参照文献 [9]，进行鸭常见病毒（RT-）PCR检测。

1.6 病毒分离与鉴定

将采集的内脏和皮肤组织分别剪碎、匀浆，加入PBS制成1∶5组织悬液，反复冻融3次，6 000 r·min−1离心10 min，加双抗作用30 min后，用220 nm滤器过滤。滤液各以200 μL·枚−1经尿囊腔接种9日龄番鸭胚5枚37 ℃恒温孵化，连续观察7 d，无菌收集死亡胚尿囊液，盲传3代，收集尿囊液，对收集的尿囊液进行鸭常见病毒（RT-）PCR检测。样品于−80 ℃储 存备用。

1.7 序列测定与分析

使用引物UL2F/UL2R扩增新分离鸭瘟病毒的UL2基因，按照EasyPure Viral DNA/RNA提取试剂盒说明，提取样品中病毒核酸。获得的DNA样品用Easy Script One-Step PCR SuperMix试剂盒按说明书进行PCR扩增，PCR反应按50 μL体系进行扩增：2×Easy Taq PCR Super Mix 25 μL，ddH2O 17.5 μL，上下游引物各1.25 μL，DNA模板5 μL。反应程序为：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s，56 ℃退火60 s，72 ℃延伸10 min，35个循环。扩增产物送福州 铂尚生物技术（上海）有限公司进行测序。

1.8 组织病理学观察

对上述（1.3）固定的组织依次按照修块、冲洗、脱水、透明、浸蜡、包埋、切片（4 μm）的步骤制备病理切片，经HE染色后于光学显微镜下观察病理组 织学变化，拍照记录。

2 结果与分析

2.1 剖检病变

送检病鸭可见头颈肿胀（图1-A），皮肤表面有大量散在的点状或块状出血（图1-B），肝脏肿胀，外观呈不均匀斑驳状，表面有不规则的出血点或出血斑（图1-C）。

图 1 发病鸭鸭剖检病变图Fig. 1 Necropsy lesions in diseased ducks.

2.2 实验室检测

2.2.1 细菌分离结果 无菌挑取病死鸭脑及肝脏组织接种于不同培养基平板，37 ℃培养48 h后，所接种 平板均未见菌落生长，因此可排除细菌感染。

2.2.2 （RT）PCR检测 ? 对临床样品进行鸭瘟、禽流感、新城疫、鸭肝炎、禽坦布苏病毒、水禽细小病毒、鸭3型腺病毒、禽4型腺病毒、呼肠孤病毒、鸭星状病毒和鸭圆环病毒等鸭常见病原检测，结果在实质脏器及皮肤组织中均检测出鸭瘟病毒，其余病原检测均为阴性（图2）；由此，可初步判断该 病例为DPV感染所致。

2.3 病毒分离与鉴定

将病鸭内脏和皮肤组织匀浆液分别接种9日龄番鸭胚，48～144 h可陆续观察到胚体死亡，死亡胚体出现水肿和出血。收集接种后死亡鸭胚尿囊液，对收集尿囊液和胚体按1.5方法进行（RT-）PCR检测，结果均为DPV阳性（图3），表明新分离病毒为 鸭瘟病毒，将该株病毒命名为FJ2020176。

2.4 UL2基因序列测定与分析

以新分离鸭瘟病毒核酸为模板，进行UL2基因扩增，结果获得包含UL2全基因的1 311 bp片段，与预期相符（图4）。

对新分离鸭瘟病毒UL2基因序列进行测定，去除前后多余的核苷酸序列，获得全长为1 002 bp的UL2基因完整序列，将测得序列上传至NCBI数据库，获得GenBank登录号为MW032438。序列比对分析显示，新分离株FJ2020176 UL2基因与DPV强毒株CHv株、CV株和2085株核苷酸相似性高达97.8%～99.9%（图5）。与疫苗株VAC株、Attenuated strain 1株和Attenuated strain 2株相比，新分离鸭瘟病毒FJ2020176株在UL2基因中存在528 bp的核苷酸 插入，表明FJ2020176株为鸭瘟病毒强毒株。

图 2 临床采集样品的PCR检测Fig. 2 PCR detection on clinical samples

图 3 临床采集样品的PCR检测Fig. 3 PCR detection on clinical samples

图 4 分离病毒的PCR扩增结果Fig. 4 PCR amplification result on isolated virus

2.5 组织病理学观察

组织病理学观察可见肝脏发生局灶性坏死，肝脏出血、肝细胞坏死（图6-A、B）；脾脏组织白髓减少，淋巴细胞坏死、脱落（图6-C、D）；肾脏出血、淤血，肾小管上皮细胞变性、坏死（图6-E、F）；法氏囊出血，淋巴小结坏死（图6-G、H）；皮下出血（图6-I、J）。

图 5 鸭瘟病毒UL2基因同源性分析Fig. 5 Homology on UL 2 gene of duck plague virus

图 6 感染鸭组织病理切片Fig. 6 Pathological slices of infected duck tissues

3 讨论与结论

我国的鸭瘟病毒抗原性高度保守，相关疫苗的使用对该病可起到显著的预防效果[1]。但近年来，我国养鸭场中常出现已免疫鸭群发病的情况[6,11]，加之缺少典型病变鸭瘟病例的出现[7]，使得鸭瘟的诊断和防控形势变得愈加复杂。因此，在临床上，除了观察患病鸭的特征性病变外，还应结合实验室诊断，以免出现误诊。

DPV侵染机体可引起实质器官渐进性的退行性变化，以及由于血管损伤而引起的组织出血和体腔溢血[12]，本病例临床剖检可见肝脏的轻微肿大、出血。较为特别的是，临床症状除了头颈肿胀这一鸭瘟典型症状外，还表现为皮肤的大面积出血，此症状在以往的报道中未曾出现。同时，从皮肤中成功分离出鸭瘟病毒，表明此株鸭瘟病毒入侵的靶器官可能还包括皮肤组织，病毒的组织嗜性是否有所改变，还需进一步研究。对FJ2020176株的UL2基因进行分析发现，其与强毒株CHv株、CV株和2085株有极高的同源性；与弱毒株相比，在UL2基因中间有528 bp的插入，符合鸭瘟强毒株特征[13]，表明新分离的DPV为鸭瘟病毒强毒株。

组织病理学观察显示，DPV对感染鸭内部组织器官有不同程度的损伤，其中以肝脏、脾脏、肾脏等实质脏器出血、淤血最为明显。脾脏和法氏囊是禽类重要的免疫器官，这些免疫器官在识别和清除体内的抗原性异物和自身变性细胞中具有重要作用[14]。本病例的脾脏和法氏囊也有一定程度的病变，病理组织学观察可见感染鸭脾脏红髓和白髓结构不清，白髓内淋巴细胞减少；法氏囊淋巴细胞出现缺失和坏死，预示着患鸭免疫功能可能下降，机体易受到其他病原体的侵害。肝脏和肾脏也有相似的病变，表现为肝、肾的出血、瘀血和相关组织细胞的坏死，由此可见，患鸭的免疫系统、消化系统和泌尿系统均已遭到病毒损坏。外部组织的病变则以皮下大面积出血为特征，组织病理学观察可见皮下有大量出血、淤血，与临床剖检结果一致。此次送诊的病例，除皮肤的病理变化外，其余各脏器病理变化均与已报道的鸭瘟病变基本相符[15,16]。

未免疫鸭瘟疫苗是该场鸭群发病的主要原因，因此在生产过程中，应提高免疫意识，制定合理的免疫程序，选择合适疫苗及时免疫，切不可掉以轻心，以免造成损失。本研究对一起皮肤大量出血的发病鸭群进行病原分离鉴定及病理组织学观察，并从该发病鸭皮肤组织中分离到一株鸭瘟病毒强毒株，表明皮肤出血亦为鸭瘟病例的临床特征。以上结果为临床上鸭瘟的诊断提供了新的试验数据。