绿豆萌发期耐旱种质资源筛选评价和遗传多样性分析

黄年英，朱珍珍，刘昌燕，廖芳丽，李 莉，陈宏伟，刘良军，韩雪松，万正煌 ，沙爱华

（1. 长江大学农学院/主要粮食作物产业化湖北省协同创新中心，湖北 荆州 434025；2. 湖北省农业科学院粮食作物研究所/粮食作物种质创新与遗传改良湖北省重点实验室，武汉 430064；3. 荆州市种子管理局，湖北 荆州 434020）

0 引言

【研究意义】绿豆[Vigna radiata（L.）Wilczek]，属菜豆族（Phaseoleae）豇豆属（Vigna），是我国传统的豆类食物，广泛种植于华北、西北和东北等主产区及其他省份[1]，绿豆播种季节常因降雨量少而影响绿豆种子萌发，严重限制了绿豆生产的发展[2,3]。除了引水灌溉，筛选耐旱绿豆种质资源、培育耐旱品种是解决这一问题的根本途径。萌发期是植株正常生长发育的关键时期，而土壤水分含量会直接影响种子萌发，因此萌发期是研究植物耐旱性的关键时期。对绿豆种质资源萌发期耐旱性进行评价及筛选耐旱种质，可为绿豆耐旱品种选育及品种改良提供参考[4]。【前人研究进展】近年来，绿豆种质筛选方面的研究已有较多报道，刘晨旦等[5]采用15% 的PEG-6000 高渗溶液对 58 份绿豆品种进行干旱模拟胁迫，测定其发芽率、发芽势、发芽指数、活力指数和相对根长等指标，对不同基因型绿豆品种的耐旱性进行了鉴定，筛选出1份高耐和4份耐性品种。王兰芬等[6]利用抗旱性系数、隶属函数和抗旱性指数对绿豆的抗旱性进行评价，指出3种方法相关性极高，适宜于绿豆抗旱鉴定评价。Ali等[7]根据绿豆种子萌发特性与幼苗抗氧化潜能及养分吸收的关系，研究了不同绿豆品种的耐旱性。高运青等[8]运用灰色关联度分析方法，对29份不同来源绿豆种质资源进行综合评价，筛选出6份综合性能较好的绿豆品种，并依据聚类分析将其资源聚为4 类。基于分子聚类的方法能够准确揭示不同种质之间的遗传关系，为应用不同种质开展相关育种提供参考，绿豆中也有较多研究报道。Sunayana等[9]对60份不同基因型绿豆在夏季限湿条件下的遗传差异进行了评价，基于19个表型标记，层次聚类分析确定了9个大类，包含1～15个基因型。叶卫军等[10]开发了274 2个SSR标记，通过聚类分析将90份材料分为2个类群，具有相同地理来源的材料多数可以聚在一起或成簇状分布。赵雅楠等[11]利用 15 对SSR引物对东北三省地区 156 份绿豆种质资源进行遗传多样性分析，在遗传相似系数为 0. 478 的阈值处将参试个体分为 5 个组群，相同地理来源品种大多成簇分布。【本研究切入点】前人研究虽然鉴定出了一些耐旱绿豆种质，但仍无法满足生产需求。本研究拟通过评价收集的56份绿豆种质萌发期耐旱性，期望鉴定出新的耐旱绿豆种质，并明确其遗传基础，以满足绿豆耐旱育种的需要。【拟解决的关键问题】以相对发芽率、相对发芽势和相对根长等10个指标作为耐旱性评价指标，通过主成分分析、隶属函数分析和多元分析方法鉴定绿豆种质耐旱性。基于SSR扩增对56份种质资源进行分子聚类，明确其遗传基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试的56份绿豆种质材料及来源地如表1所示，均 由湖北省农业科学院粮食作物科学研究所提供。

1.2 耐旱种质资源筛选试验设计

1.2.1 试验准备 选取优质、饱满的种子在10%Naclo溶液中浸泡5 min，然后用无菌水洗涤3～4次。均匀摆入铺有双层滤纸的培养皿中，甘露醇处理和蒸馏水对照处理（CK）均3次重复，每个重复放25粒种子，用15 mL甘露醇溶液或蒸馏水浸润，培养皿放置在人工培养箱黑暗发芽，温度为25 ℃，每天定时补 充少量溶液或水。

1.2.2 耐旱性相关指标测定 从种子放置培养皿第2天开始每日定时统计发芽种子数。第8天从每个培养皿中随机选取10株正常生长的幼苗测定其根长、芽长及其鲜重等指标，并计算平均值。发芽相关指标按农作物发芽技术规定（GB/T 35434 1995）测量计算，各指标公式如下：

相对发芽率（RGR，relative germination rate）=第8 d发芽种子数/供试种子数×100%

发芽率（GR，germination rate）=第8 d发芽种子数/供试种子数×100%

相对发芽势（RGE，relative germination energy）=（处理发芽势/对照发芽势）×100%

发芽势（GE，germination energy）=（第5 d的发芽种子数/供试种子数）×100%

表 1 56份绿豆材料编号及基本信息Table 1 Codes and basic information of 56 mung bean germplasms

相对根长（RRL，relative Root length）=（处理根长/对照根长）×100%

相对胚轴长（RPL，relative plumular axis length）=（处理胚轴长/对照胚轴长）×100%

相对芽长（RBL，relative bud length）=（处理芽长/对照芽长）×100%

相对芽干重（RSDW，relative shoot dry weight）=（处理芽干重/对照芽干重）×100%

相对芽鲜重（RSFW，relative shoot fresh weight）=（处理芽鲜重/对照芽鲜重）×100%

活力指数（VI，vigor index）=（相对苗高×相对发芽率）×100%

相对苗高（RBL，relative bud length）=（处理苗高/对照苗高）×100%

萌发耐旱指数（GDRI，germination drought tolerant index）=渗透胁迫下的萌发指数/对照萌发指数，萌发指数（GI，germination index）=（1.00）nd2+（0.75）nd4+（0.5）nd6+（0.25）nd8（其中，nd2、nd4、nd6、nd8分别为第2、4、6、8 d的种子发芽率，1.00、0.75、0.50、0.25分别为相应萌发时间所赋予的耐旱系数）

萌发胁迫指数（GSI，germination stress index）=处理种子发芽指数/对照种子发芽指数

发芽指数（GI，germination index）=Ʃ（DG/DT）（DG为逐日发芽数，DT为相应DG的发芽天数）

萌发耐旱性指数和萌发胁迫指数的计算方法参照 李玲等[12]的方法。

1.2.3 数据统计分析 采用Microsoft Excel 2010 进行数据统计、计算及隶属函数分析，DPS 7.01 统计软件进行数据相关性分析及主成分分析。相关公式如下：

式中，U（Xj）表示j指标的隶属函数值，Xj为某个指标的实际测量值，Xjmax、Xjmin分别为该指标的最大值和最小值。

权重计算公式：

式中，Pj表示第j个综合指标的贡献率。综合评价D值计算公式：

参考王利彬等[13]的大豆耐旱性鉴定方法，把耐旱级别划分为5个等级：1级：D≥0.8，高耐；2级：0.6≤D＜0.8，耐；3级：0.4≤D＜0.6，中耐；4级：0.2≤D＜0.4，较敏感；5级：D＜0.2，敏感。

1.3 SSR试验设计

1.3.1 DNA提取和PCR扩增 取室温下种植的绿豆新鲜幼叶叶片，用十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）提取基因组DNA，并用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量。并将DNA稀释至50 ng·μL−1，选用34对SSR引物[14]对绿豆进行SSR标记分析（表2）。反应体系总体积为15 μL，包含 Taq聚合酶0. 2 μL，10×Buffer 1.5 μL，dNTP 0.4 μL，引物各0.6 μL，模板DNA 1.5 μL，ddH2O 10. 2 μL。PCR扩增在TGreat Gradient

表 2 用于遗传多样性分析的34对引物信息Table 2 Thirty-four pairs of primers used for genetic diversity analysis

Thermal Cycler OSE-GP-01型PCR仪上进行。反应程序为94 ℃预变性5 min；94 ℃ 变性30 s，53～60 ℃复性30 s，72 ℃延伸30 s，35个循环；最后72 ℃终延伸10min。PCR产物用6.0% PAGE电泳分析，银染后读带。每个基因座的等位基因数（Na）和多态性 信息含量（PIC值）均作为多样性参数[15]。

1.3.2 数据统计分析 同一对SSR引物扩增带（等位基因变异）在电泳板相同位置有带记为 1，无带记为0。使用PowerMarker 3.4计算遗传多样性参数。利用NTSYS-PC 2.1软件生成遗传相似系数，并进行聚 类分析。

2.1 10%的甘露醇溶液模拟干旱胁迫对绿豆种质耐旱性相关指标的影响

在10%甘露醇溶液和蒸馏水对照下测量56种绿豆种质的发芽指标（表3）。发芽势为4.00%～88.00%，平均值为44.32%，较对照变化率为−54.12%；发芽率为28.00%～100%，平均为64.74%，变化率为−33.67%；其他发芽相关指标也表现出受到明显抑制作用，芽鲜重变化率最大为−99.00%，其次为活力指数变化率为−96.81%，根长、胚轴长、芽长、芽干重、发芽指数、萌发指数变化率分别为−93.1%、−92.14%、−95.4%、−96.00%、−73.04%、−70.51%。因此，干旱胁迫对种子萌发的抑制作用体现在多个性状，抑制程度也存在差异。比较处理组与对照组，处理组芽长与芽干重的变异系数分别降低14.29%和2.33%，其发芽势变异系数增加9.52倍，胚轴长、萌发指数、发芽指数、发芽率、简易活力指数、芽鲜重和根长分别增加9.00倍、7.20倍、5.67倍、0.84倍、0.78倍、0.53倍、0.36倍（表3）。

表 3 56份绿豆材料萌发期蒸馏水和10%甘露醇干旱胁迫下各指标的变化与比较Table 3 Evaluation indicators (mean+SD) on seeds of 56 mung bean germplasms germinated under water or 10% mannitol treatment

2.2 不同绿豆种质资源萌发期耐旱性评价指标的主成分分析

主成分分析获得的前三个综合指标的贡献率分别为57.87%，16.42%和11.42%，累积贡献率达85.71 %（表4），表明前3个相互独立的主成分能够代表10个指标的变异信息。将其命名为3个全新的相互独立的综合指标，顺序定义为第 1、第2、第 3主成分（Comprehensive index，CI1、CI2和 CI3）。

2.3 不同绿豆种质资源萌发期耐旱性的综合评价

在干旱胁迫处理，CI 1中种质No.3的 隶属函数值U（Xj）最小，而No.13的 U（Xj）最大（表5）, 表明以 CI 1作为评价指标时，No.3和 No.13分别对干旱表现为敏感和高耐。根据主成分分析得到的各综合指标贡献率大小（表4），计算U（X）1、U（X）2和U（X）3的权重值Wj，分别为 0.675、0.192和0.133。进一步根据U（Xj）和相应Wj进行加权计算得到的综合评价值D对56份种质耐旱性进行评价，发现No.13 的D值最大，而No.3的 D 值最小（表5），表明它们分别为最耐旱和最敏感种质。

2.4 耐旱性分类结果

根据各种质资源的综合评价D值，按耐旱性分级标准将56个绿豆品种分为高耐、耐、中耐、敏感和高敏 5个等级。其中中绿14号（No.13）和中绿17号（No.16）表现为高耐；10 份种质（No.01，08，18，20，21，22，37，40，48，52）表现为耐旱，占供试材料的17.86%；中耐种质30 份，分别为No.02，04，06，07，09，10，11，14，15，17，19，23，26，28，34，35，36，39，41，42，43，44，45，46，49，50，51，54，55和56，占供试材料的53.58%；敏感材料13份，分别为No.05，12，24，25，27，29，30，31，32，33，38，47和53，占供试材料的23.21%；高敏材料1份，为中绿3号（No.03）。

表 4 主成分分析Table 4 Results of principal component analysis

2.5 遗传多样性分析

利用SSR标记研究遗传多样性，等位基因数为2～12个，平均等位基因数为5.5个，PIC值的变幅为0.03～0.67，平均值为0.27。34对引物共扩增出191条DNA条带，得到187条多态性条带（等位基因）（表6）。基于SSR聚类将56个种质在D-0.64分为3个主要类群（图1）。第一类群（Ⅰ）共有25个种质资源（No.01、22、02、11、09、15、17、42、16、34、41、14、18、23、39、05、07、13、36、21、44、24、25、47、48），其中84%为中耐、耐旱和高耐。值得注意的是2个高耐品种（No.13和No.16）聚在相近亚群，而3个敏感种质No. 24，No.25和No.47聚在另外相近亚群。第二类群（Ⅱ）由26个种质组成，其中70%为中耐和耐旱。此外，大部分敏感或高敏种质都聚于相近亚群，例如No.03和No.38在一个小亚群中，No.32、29、33、30、53聚在相近亚群。第三类群（Ⅲ）仅包括2份敏感3份中耐种质。以上结果表明，第一组种质可能较耐旱，具有相似的遗传基础。第二组种质遗传基础复杂，表现出不同程度的耐旱性，第三组种质可能偏敏感。

表 5 56个绿豆品种的综合指标、指标权重、隶属函数和综合评价（D值）Table 5 Comprehensive indices, index weights, subordinate function, and comprehensive evaluation D value on 56 mung bean germplasms

表 6 34对SSR引物在绿豆中的多态性Table 6 Polymorphisms of 34 pairs of SSR primers in mung beans

3 讨论与结论

甘露醇模拟干旱的试验方法被广泛应用于马铃薯[16]、狗尾草[17]、玉米[18]、高粱[19]、油菜[20]等作物中。种子发芽率是衡量种子活力的重要指标之一，但是如果将其作为衡量种子耐旱性的唯一标准，很难全面反映种子萌发期的耐旱性，因此必须建立一套更加综合全面的种子萌发耐旱评价体系。

本文参考其他作物[12，13，18，21，22]耐旱性鉴定方法，在绿豆中建立了一种基于多项综合指标评价种子萌发期耐旱性的方法。通过采用这一方法评估56份绿豆种质的萌发耐旱性，鉴定出2份高耐（中绿14和中绿17）和1份高敏种质（中绿3号），其他种质分别鉴定为耐（17.86%）、中耐（53.38%）和敏感（23.21%）。这56份种质中，刘晨旦等[5]对中绿1号（No.01）、中绿2号（No.02）、中绿10号（No.09）、潍绿5号（No.23）、中绿5号（No.05）、中绿8号（No.07）、晋7（No.44）、中绿3号（No.03）、冀绿2号（No.40）、中绿11号（No.10）、晋8（No.45）、保绿942（No.46）、白绿9号（No.50）和白绿10号（No.51）已做过芽期抗旱性鉴定[5]。与之相比，大部分品种的抗性鉴定一致，表现为中耐和耐。但是其中3个品种的抗性鉴定结果存在差异：中绿3号、中绿5号和中绿10号本文分别鉴定为高敏、敏感和中耐，而刘晨旦等[5]分别鉴定为中抗、中抗和高抗。出现这种偏差的原因可能在于本文用到的干旱模拟剂为甘露醇，而刘晨旦等[5]用的是PEG-6000。另外本文以10个耐旱评价相关指标进行综合评价，而刘晨旦等[5]只选用了其中的4个指标采用隶属函数值进行评价。尽管如此，大部分品种2种方法鉴定结果一致，表明2种方法都能比较准确的用于鉴定绿豆芽期耐旱性。

在耐旱性鉴定的基础上，进一步明确其遗传基础，将有利于在育种中有针对性的利用这些种质资源。SSR 标记可以产生足够多的多态性条带以区分绿豆种质的遗传多样性。本研究34对引物中，PIC平均为0.27，最高为0.67（表6），稍低于前人研究结果[11,15]，可能是由于引物数量较少导致。基于SSR的聚类图将56个种质分为三大类，分别表现出不同的耐旱性（第II类群，图1）。同时，同一类群中可能在某些位点具有相近的遗传基础，但由于其他位点遗传基础不同，因而同一类群中的不同种质也有可能表现出不同的耐旱性（第II类群，图1）。也有可能由于本文用于聚类的SSR引物数量偏少，导致未能将第II类群中种质的遗传基础完全分开，因而出现了不同耐旱性的种质聚在同一类群。

图 1 56份绿豆基于SSR遗传相似性的聚类图Fig. 1 Dendrogram of 56 mung bean germplasms clustered by SSR genetic similarity

总之，本文采用综合指标评价了56份绿豆种质的萌发期耐旱性，鉴定出2份高耐种质，可以为绿豆耐旱育种提供资源。同时，也可为从分子水平解析绿豆萌发耐旱机制奠定基础。