miR-92a-3p靶向调控NOTCH信号通路对T-ALL细胞增殖的影响机制

胡敏利，应双伟，罗文达

(温州医科大学附属台州医院血液肿瘤内科，浙江台州 317000)

急性淋巴细胞白血病(ALL)是一种儿童常见的血液系统恶性肿瘤，其中约有15%为急性T淋巴细胞白血病(T-ALL)[1-2]，而T淋巴细胞恶性增殖是T-ALL的重要特征之一[3-4]。微小RNA(miRNA)是一类广泛存在于真核生物体内的非编码RNA，可通过靶向相关基因调控细胞增殖，与包括T-ALL在内的多种疾病的发生、发展密切相关[5-8]。miR-92a-3p在T-ALL中异常低表达[9]，但其是否参与T-ALL细胞增殖过程并不清楚。本研究通过上调和下调miR-92a-3p表达观察miR-92a-3p对T-ALL SupT1细胞增殖的影响，并探讨其可能的分子机制，旨在揭示miR-92a-3p在T-ALL发病中的作用。

1 材料与方法

1.1 材料

miR-92a-3p模拟物及其抑制剂(货号：M-01-S、M-02，上海吉玛)，果蝇翅膀边缘出现缺口(NOTCH)信号通路相关蛋白NOTCH1、Jagged1、Hes1和β-肌动蛋白(β-actin)抗体(货号：ab194123、ab85763、ab108937、ab179467，英国Abcam)，噻唑蓝(MTT)、十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)凝胶制备试剂盒(货号：M8180、P1200，北京索莱宝)，SYBR Premix Ex Taq试剂盒(货号：DRR420A，日本TAKARA)。

1.2 方法

1.2.1分组与处理

实验分为4组，未转染组：正常培养；阴性对照组：转染阴性对照；模拟物组：转染miR-92a-3p模拟物；抑制剂组：转染miR-92a-3p抑制剂，每组设置3个复孔。将T-ALL SupT1细胞解冻复苏后，用含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 μg/mL链霉素的RPMI-1640培养基在5% CO2、湿度饱和的37 ℃恒温培养箱内培养。将对数生长期的SupT1细胞种植到6孔板上后，培养至70%～80%融合度时，按照脂质体2000说明书根据实验分组分别将miR-92a-3p模拟物、miR-92a-3p抑制剂和阴性对照转染至SupT1细胞中。转染48 h后，收集各组细胞进行后续实验。

1.2.2实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测

Trizol试剂提取细胞总RNA，行逆转录；以逆转录产物为模板，根据上海生工生物合成的引物，上RT-qPCR仪进行扩增，具体步骤参照SYBR Premix Ex Taq试剂盒说明书。以U6为内参，采用2-ΔΔCt法计算miR-92a-3p表达水平。实验重复3次。引物序列，miR-92a-3p正向：5′-CAC TTG TCC CGG CCT GTA AA-3′，反向：5′-TAT TGC ACT TGT CCC GGC CTG-3′；U6正向：5′-GCT TCG GCA GCA CAT ATA CTA AAA T-3′，反向：5′-CGC TTC ACG AAT TTG CGT GTC AT-3′。

1.2.3MTT检测

将对数生长期的SupT1细胞种植到96孔细胞板上后，培养至70%融合度时，按照1.2.1中的分组处理细胞；转染24、48、72、96 h后，每孔加入MTT工作液孵育4 h；再加入二甲基亚砜工作液震荡反应15 min。采用多功能酶标仪在450 nm波长处检测各组细胞光密度值。实验重复3次。

1.2.4流式细胞仪检测

收集各组SupT1细胞，以预冷的磷酸盐缓冲液(BPS)漂洗2遍后，在4 ℃下使用70%乙醇固定过夜；BPS漂洗后，加入核糖核酸酶A避光温浴30 min；经碘化丙啶4 ℃下染色30 min后，上流式细胞仪检测各组细胞周期分布情况。实验重复3次。

1.2.5Western blot检测

抽提待测SupT1细胞总蛋白后，采用考马斯亮蓝染色法检测蛋白浓度与纯度。将变性后的蛋白样品行SDS-PAGE电泳后，转膜；室温下以5%脱脂奶粉封闭2 h后，加入一抗工作液(NOTCH1 1∶800、Jagged1 1∶200、Hes1 1∶200和β-actin 1∶1 000)孵育2 h；室温下辣根过氧化酶标记的二抗(1∶2 000)孵育2 h后，使用化学发光剂显影，以β-actin为内参，采用凝胶成像分析系统扫描分析SupT1细胞中NOTCH1、Jagged1和Hes1蛋白表达水平。实验重复3次。

1.2.6双荧光素酶报告基因(DLR)实验

将与miR-92a-3p互补结合的NOTCH1 3′UTR序列片段及定点突变后的NOTCH1 3′UTR序列片段克隆重组至pGL3-basic荧光素酶报告基因载体上，分别作为NOTCH1野生型(NOTCH1-Wt)和NOTCH1突变型(NOTCH1-Mut)载体质粒。将NOTCH1-Wt、NOTCH1-Mut分别与阴性对照、miR-92a-3p模拟物、miR-92a-3p抑制剂共转染至SupT1细胞中，其中每组设3个复孔。转染48 h后，检测各组细胞荧光素酶活性，具体步骤参照DLR检测试剂盒说明书。实验重复3次。

1.3 统计学处理

2 结 果

2.1 各组SupT1细胞中miR-92a-3p表达水平比较

未转染组、阴性对照组、模拟物组、抑制剂组细胞中miR-92a-3p表达水平分别为0.97±0.07、1.02±0.09、16.48±2.16、0.19±0.02。与未转染组比较，阴性对照组SupT1细胞中miR-92a-3p表达水平差异无统计学意义(P>0.05)；与阴性对照组比较，模拟物组SupT1细胞中miR-92a-3p表达水平明显升高，而抑制剂组SupT1细胞中miR-92a-3p表达水平明显降低(F=478.458，P<0.001)。

2.2 各组SupT1细胞增殖活力比较

与未转染组比较，阴性对照组不同时间SupT1细胞增殖活力无明显变化(P>0.05)；与阴性对照组比较，模拟物组48、72、96 h后SupT1细胞增殖活力明显减弱，而抑制剂组48、72、96 h后SupT1细胞增殖活力明显增强(P<0.05)，见表1。

2.3 各组SupT1细胞周期分布情况

与未转染组比较，阴性对照组SupT1细胞在G0/G1期、S期和G2/M期所占百分比比较差异无统计学意义(P>0.05)；与阴性对照组比较，模拟物组SupT1细胞在G0/G1期所占百分比明显升高，且在S期和G2/M期所占百分比明显降低(P<0.05)；而抑制剂组SupT1细胞在G0/G1期所占百分比明显低于阴性对照组，且在S期和G2/M期所占百分比明显高于阴性对照组(P<0.05)，见图1、表2。

2.4 各组SupT1细胞中NOTCH信号通路相关蛋白表达水平比较

与未转染组比较，阴性对照组SupT1细胞中NOTCH信号通路相关蛋白NOTCH1、Jagged1和Hes1表达水平差异均无统计学意义(P>0.05)；与阴性对照组比较，模拟物组SupT1细胞中NOTCH1、Jagged1和Hes1表达水平明显降低(P<0.05)，而抑制剂组SupT1细胞中NOTCH1、Jagged1和Hes1表达水平明显升高(P<0.05),见图2、表3。

表1 各组SupT1细胞增殖活力比较

图1 流式细胞仪检测各组SupT1细胞周期分布情况

表2 各组SupT1细胞周期分布情况比较

1：未转染组；2：阴性对照组；3：模拟物组；4：抑制剂组。

2.5 miR-92a-3p和NOTCH1靶向关系预测及验证

miR-92a-3p与NOTCH1 3′UTR存在互补的结合位点(图3)。与阴性对照和NOTCH1-Wt共转染细胞比较，miR-92a-3p模拟物和NOTCH1-Wt共转染细胞的荧光素酶活性明显降低，而miR-92a-3p抑制剂和NOTCH1-Wt共转染细胞的荧光素酶活性明显升高(P<0.05)；但miR-92a-3p模拟物和miR-92a-3p抑制剂对转染NOTCH1-Mut细胞的荧光素酶活性无明显影响(P>0.05)，见表4。

表3 各组细胞NOTCH1、Jagged1及Hes1蛋白表达水平比较

表4 各组细胞荧光素酶活性比较

图3 miR-92a-3p与NOTCH1靶向结合位点

3 讨 论

T-ALL中细胞增殖影响疾病进程，因此，发现影响T-ALL的基因对于T-ALL疾病治疗意义重大。miRNA作为短RNA序列，在疾病发生、发展过程中发挥重要作用，其中miR-92a-3p是miR-17-92家族成员，可通过调控细胞生物学行为参与多种疾病的发生、发展[10]；有研究发现，在结直肠癌中miR-92a-3p表达受阻可减弱癌细胞增殖能力，miR-92a-3p可能是结直肠癌治疗的重要靶点[11]；miR-92a-3p可抑制前体脂肪细胞增殖和促进细胞分化，与肥胖症的发生密切相关[12]。有学者在T-ALL中发现miR-92a-3p表达下调[9]，但作用机制尚不清楚。本研究中发现，上调miR-92a-3p人T-ALL SupT1细胞增殖活力明显降低，G0/G1期所占百分比明显升高；下调miR-92a-3p后SupT1细胞增殖活力明显增强，且细胞在S期和G2/M期所占百分比明显升高。表明上调miR-92a-3p可通过诱导细胞周期阻滞于G0/G1期抑制SupT1细胞增殖，而下调miR-92a-3p可通过加速细胞周期于S期促进SupT1细胞增殖。提示miR-92a-3p可能通过调控细胞增殖在T-ALL发生、发展过程中发挥着作用。

NOTCH信号通路是细胞内重要的信号转导途径之一，可激活下游Hes家族和p21等靶基因，进而在细胞增殖、分化和凋亡等过程中发挥着重要作用[13-14]，且与T-ALL的发生、发展密切相关。NOTCH信号通路的活化在T-ALL细胞增殖过程中发挥着重要的促进作用[15]。靶向抑制NOTCH1表达可影响下游相关基因转录，诱导细胞周期阻滞于G0/G1期，抑制细胞增殖[16]。本研究发现，上调miR-92a-3p表达可引起SupT1细胞中NOTCH1、配体Jagged1及下游Hes1蛋白表达水平明显降低，而下调miR-92a-3p表达则出现相反的结果。提示在T-ALL中miR-92a-3p可能通过抑制NOTCH信号通路活化进而发挥抑制细胞增殖的作用。miR-92a-3p与NOTCH1 3′UTR存在互补的结合位点。提示miR-92a-3p可能通过靶向NOTCH1抑制NOTCH信号通路活化进而抑制细胞周期阻滞于G0/G1期，从而抑制T-ALL细胞增殖。

综上所述，miR-92a-3p靶向调控NOTCH信号通路诱导细胞周期阻滞，进而发挥抑制SupT1细胞增殖的作用，本文验证miR-92a-3p在T-ALL中的机制，以为临床上miR-92a-3p的靶向治疗提供依据。