CD100对乙型病毒性肝炎患者外周血CD8+T细胞功能的影响①

王新伟 杨道坤 梁海军 高海丽 王燕平

（新乡医学院第一附属医院感染疾病科，卫辉453100）

乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）感染所致临床结局与机体免疫状态密切相关，急性HBV感染可诱导机体细胞免疫增强及IFN-γ和肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor-α，TNF-α）水平升高，促进病毒清除，而慢性HBV感染则诱导机体免疫耐受，导致病毒持续感染，但具体机制尚未阐明［1］。CD100是免疫信号素家族成员，在体内存在2种形式：可溶型CD100（soluble CD100，sCD100）和膜型CD100（membrane-bound CD100，mCD100），可调控机体免疫系统功能，参与多种病毒感染性疾病发病过程［2-3］。最新研究发现，CD100参与HBV感染小鼠模型体内免疫系统功能调控，但对乙型肝炎患者CD8+T细胞的调控作用及相关机制尚未阐明［4］。因此，本研究检测CD100在乙型肝炎患者中的表达，观察重组CD100对乙型肝炎患者CD8+T细胞功能的影响，为阐明HBV感染的免疫应答和炎症损伤机制提供实验依据。

1 资料与方法

1.1 资料

1.1.1 主要试剂 淋巴细胞分离液（北京索莱宝公司）；CD8+T细胞分选试剂盒（德国美天旎公司）；抗CD3/CD28（美国eBioscience公司）；重组人CD100（美国R&D公司）；CD100、IFN-γ和TNF-α ELISA检测试剂盒（武汉华美公司）；抗CD3-APC、抗CD8-APC Cy7、抗CD100-PE（美国BD公司）；穿孔素、颗粒酶B酶联吸附斑点试验（enzyme linked im‐munospot assay，ELISPOT）检测试剂盒（美国Abcam公司）；乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH）细胞毒性检测试剂盒（武汉碧云天公司）。

1.1.2 主要仪器 SORVALL高速低温离心机（美国Kendor公司）；磁力分离架（德国美天旎公司）；M680型全自动酶标仪（美国BioRad公司）；FACS‐Calibur流式细胞仪（美国BD公司）；ELISPOT读板仪（德国AID公司）。

1.1.3 研究对象 本研究方案已通过新乡医学院第一附属医院伦理委员会批准。选择2018年12月至2019年7月在我院感染疾病科就诊的急性乙型肝炎（acute hepatitis B，AHB）患者13例和慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B，CHB）患者30例，入选条件：①年龄＞18岁且＜60岁；②未接受抗病毒或免疫调节治疗；③HBsAg、HBeAg和抗HBc阳性；④患者及家属知情同意。排除条件：①合并其他嗜肝病毒感染，如丙型肝炎病毒（hepatitis Cvirus，HCV）、丁型肝炎病毒、人类免疫缺陷病毒等；②合并失代偿期肝硬化、肝衰竭、原发性肝癌等终末期肝病；③合并恶性肿瘤；④合并自身免疫性疾病；⑤合并心脏、脑、肾脏等重要脏器功能衰竭；⑥妊娠期妇女。选取同期在我院进行体检、年龄、性别相匹配的17例健康志愿者作为对照。一般资料见表1。

1.2 方法

1.2.1 外周血单个核细胞（peripheral blood mono‐nuclear cell，PBMCs）分离和CD8+T细胞分选 清晨、空腹采集外周血20 ml，1 000/rmin离心10 min分离血浆，采用淋巴细胞分离液、密度梯度离心法分离PBMCs。采用CD8+T细胞分选试剂盒对20例CHB患者的CD8+T细胞进行分选，取1×107个PBMCs，1 000/rmin离心10 min，弃上清，40μl缓冲液重悬细胞，加入10μl生物素标记的抗体（包含抗CD4、抗CD15、抗CD16、抗CD19、抗CD34、抗CD36、抗CD56、抗CD123、抗TCRγ/δ、抗CD235a），混匀后4℃孵育5 min，加入30μl缓冲液，再加入20μl CD8+T细胞微球抗体（包含抗CD14、抗CD61、抗生物素），混匀后4℃孵育10 min。将分离柱置于磁力分离架上，3 ml缓冲液浸润，加入上述细胞悬液，收集通过分离柱的未标记细胞，即为富集的CD8+T细胞。

1.2.2 直接接触培养和间接接触培养系统构建 采用重组人CD100（终浓度2μg/ml）刺激CD8+T细胞24 h，按照PHILIPS等［5］的方法建立11例HLA-A2限制性CHB患者的CD8+T细胞和HepG2.2.15细胞直接接触和间接接触培养系统。直接接触培养系统：1×105个CD8+T细胞与5×105个HepG2.2.15细胞直接混合培养，同时加入抗CD3/CD28（终浓度1μg/ml）刺激培养。间接接触培养系统：采用Transwell培养平板，将1×105个CD8+T细胞置于上层小室，同时加入 抗CD3/CD28（终 浓 度1μg/ml），将5×105个HepG2.2.15细胞加入下层小室，采用直径为0.4μm的半透膜分隔两层小室，仅可溶性细胞因子可通过，培养48 h后收集上清。

1.2.3 ELISA检测sCD100和相关细胞因子表达取患者血浆或培养上清进行细胞因子检测。将100μl标准品和待测样本加入反应孔中，同时设立空白对照和阴性对照，用封板胶封住反应孔，37℃孵育90 min，吸出样本，250μ/l孔加入洗涤缓冲液，浸泡1 min后吸出，用吸水纸完全吸干，洗涤5次。100μ/l孔加入生物素标记的二抗，封板胶封住反应孔，37℃孵育60 min，洗板5次，100μ/l孔加入ABC工作液，封板胶封住反应孔，37℃孵育30 min，洗板5次，100μ/l孔加入TMB显色工作液，37°C避光反应，肉眼可见标准品前3～4孔有明显蓝色梯度、后3～4孔差别不明显时，即可向每孔中加入100μl TMB终止液，显色反应最长不超过30 min。酶标仪测定450 nm波长处吸光度，绘制标准曲线，计算各细胞因子浓度。

表1 一般临床资料（±s）Tab.1 Clinical characteristics（±s）

表1 一般临床资料（±s）Tab.1 Clinical characteristics（±s）

IndexAHBCHBControl Cases（n）133017 Gender（male/female）8/519/1110/7 Age（year）27.7±8.130.6±9.829.4±7.5 HBV DNA（log10 U/ml）5.11±1.676.34±1.09Not available Anti-HBc IgM（+n）1300 ALT（U/L）762［472，1 109］187［89，301］18［9，29］

1.2.4 流式细胞术检测CD8+T细胞mCD100表达将PBMCs转入FACS管中，PBS洗涤2次，加入抗CD3-APC、抗CD8-APC Cy7、抗CD100-PE，4℃避光孵育30 min，PBS洗涤2次，加入2%多聚甲醛/PBS溶液固定，FACSCalibur流式细胞仪获取细胞，Flow‐Jo10.6.1软件分析结果。

1.2.5 ELISPOT检测CD8+T细胞分泌穿孔素和颗粒酶B水平 预包被的PVDF平板100μ/l孔加入PBS，室温孵育10 min，吸水纸吸净液体，5×104个/孔加入CD8+T细胞，加入抗CD3/CD28（终浓度1μg/ml），同时设立阴性对照（无刺激源），于37℃、5%CO2条件下培养20 h，吸水纸吸净液体，100μ/l孔加入含0.1%吐温20的PBS，4℃孵育10 min，含0.1%吐温20的PBS洗涤3次。采用10 ml含有1%BSA的PBS稀释检测抗体，100μ/l孔加入稀释后的检测抗体，室温孵育90 min，含0.1%吐温20的PBS洗涤3次。100μ/l孔加入稀释的链霉亲和素碱性磷酸酶（1：5 000），室温孵育60 min，含0.1%吐温20的PBS洗涤3次，流动水彻底洗涤每孔，吸水纸吸净残留液体，100μ/l孔加入BCIP/NBT显色底物反应5～15 min，ELISPOT读板仪对显色细胞数进行计数，分析斑点形成数（spot forming count，SFC），SFC=样本SFC-阴性对照SFC。

1.2.6 靶细胞死亡比例检测 取细胞培养上清，加入96孔板，60μ/l孔加入LDH检测工作液，混匀后室温避光孵育30 min，490 nm处测定吸光度，690 nm作为参考波长进行双波长测定。以HepG2.2.15细胞单独培养上清的LDH值作为低水平对照，以Tri‐ton X100处理的HepG2.2.15细胞培养上清的LDH值作为高水平对照，靶细胞凋亡比例=（LDH高水平对照-LDH样本）/（LDH高水平对照-LDH低水平对照）×100%。

1.3 统计学处理 采用SPSS21.0软件进行统计学分析，符合正态分布的计量资料采用±s表示，组间比较采用单因素方差分析、SNK-q检验或配对t检验；不符合正态分布的计量资料采用中位数［Q1，Q3］表示，组间比较采用Wilcoxon配对检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HBV感染者血浆sCD100水平 对照组血浆sCD100水平为（5.63±1.16）ng/ml，AHB组血浆sCD100水平为（6.95±0.90）ng/ml，较对照组升高（P=0.002，图1），CHB组血浆sCD100水平为（4.89±0.95）ng/ml，较对照组降低（P=0.024，图1）。

2.2 HBV患者外周血CD8+T细胞mCD100表达 采用FSC和SSC对PBMCs中的淋巴细胞圈门，在淋巴细胞中对CD3+CD8+T细胞圈门，检测CD3+CD8+T细胞中mCD100+细胞比例，对照组、AHB组和CHB组典型mCD100检测流式散点图见图2A。对照组mCD100+细胞占CD8+T细胞比例为（68.31±10.54）%，AHB组mCD100+细胞占CD8+T细胞比例为（59.56±11.26）%，较对照组降低（P=0.037 0，图2B），CHB组mCD100+细胞占CD8+T细胞比例为（80.80±7.19）%，较对照组升高（P＜0.000 1，图2B）。

2.3 重组CD100对CHB患者CD8+T细胞分泌细胞因子的影响 无CD100刺激的CHB患者CD8+T细胞分泌IFN-γ的水平为（258.60±63.56）pg/ml，经CD100刺激后CHB患者CD8+T细胞分泌IFN-γ的水平为（302.00±62.29）pg/ml，较无刺激组升高（P=0.036 0，图3）。无CD100刺激的CHB患者CD8+T细胞分泌TNF-α 水平为（941.2±129.4）pg/ml，经CD100刺激后CHB患者CD8+T细胞分泌TNF-α的水平为（1 256.00±79.15）pg/ml，较无刺激组显著升高（P＜0.000 1，图3）。

2.4 重组CD100对CHB患者CD8+T细胞穿孔素和细胞分泌穿孔素的细胞数为（74.57［50.65，165.10］）SFC/106个，经CD100刺激后CHB患者CD8+T细胞分泌穿孔素的细胞数为（154.10［90.56，256.60］）SFC/106个，较无刺激组升高（P=0.018 0，图4）。无CD100刺激的CHB患者CD8+T细胞分泌颗粒酶B的细胞数为（59.55［48.62，96.73］）SFC/106个，经CD100刺激后CHB患者CD8+T细胞分泌颗粒酶B的细胞数为（120.10［82.61，163.80］）SFC/106个，较无刺激组升高（P=0.007 3，图4）。

图1 各组血浆sCD100水平Fig.1 Plasma sCD100 level in each group

图2 各组CD8+T细胞中mCD100表达Fig.2 mCD100 expression on CD8+T cells in each group

图3 无CD100刺激和经CD100刺激后CHB患者CD8+T细胞分泌IFN-γ和TNF-α的水平Fig.3 IFN-γand TNF-αlevels secretion by CD8+T cells from CHB patients with and without CD100 stimu⁃lation

图4 无CD100刺激和经CD100刺激后CHB患者CD8+T细胞分泌穿孔素和颗粒酶B水平Fig.4 Perforin and granzyme B levels secretion by CD8+T cells from CHB patients with and without CD100 stimulation

图5 无CD100刺激和经CD100刺激后直接接触培养和间接接触培养系统中CHB患者CD8+T细胞诱导靶细胞凋亡比例Fig.5 Percentage of target cell apoptosis by CD8+T cells from CHB patients with and without CD100 stimu⁃lation in direct contact and indirect contact co-cul⁃ture system

2.5 重组CD100对CHB患者CD8+T细胞毒性的影响 直接接触培养系统中，无CD100刺激的CHB患者CD8+T细胞诱导靶细胞死亡的比例为（14.57±2.44）%，经CD100刺激后CHB患者CD8+T细胞诱导靶细胞死亡的比例为（25.00±3.72）%，较无刺激组升高（P＜0.000 1，图5）。间接接触培养系统中，无CD100刺激的CHB患者CD8+T细胞诱导靶细胞凋亡的比例为（4.65±0.93）%，经CD100刺激后CHB患者CD8+T细胞诱导靶细胞死亡的比例为（5.09±0.95）%，（P=0.280 0，图5）。

3 讨论

多种免疫细胞和免疫分子均参与抗病毒免疫应答。CD100作为重要的免疫调控分子，在体内存在sCD100和mCD100 2种形式，mCD100在CD8+T细胞中高表达可抑制其生物学活性［6］。在基质金属蛋白酶等分子作用下，mCD100从免疫细胞表面脱落形成sCD100，sCD100则是CD100发挥生物学活性的主要形式［7］。同时，mCD100脱落后形成新的CD8lowCD100-T细胞表型是控制病毒感染的重要细胞亚群［6］。既往研究证实，CD100参与HCV感染后的免疫应答，CD100可通过与其受体相互作用增强B细胞、自然杀伤细胞及CD8+T细胞功能，促进病毒清除［3，8-10］。HBV感染可改变多种免疫分子表达模式，但CD100在HBV感染者中的表达变化及其对免疫细胞的调控作用研究较少。YANG等［4］发现，CHB患者血清sCD100表达水平降低，而T细胞表面mCD100水平升高，但未纳入AHB患者。由于机体免疫状态差异，成人感染HBV后常诱导机体产生强烈的免疫应答，短期内迅速清除病毒，而儿童时期感染HBV后由于机体免疫系统发育尚不完全，机体无法完全清除病毒，易导致感染慢性化，因此，AHB和CHB患者免疫应答存在较大差异。本研究发现，HBV感染后根据机体免疫状态的不同可导致CD100表达模式变化，急性HBV感染可诱导机体sCD100水平升高，CD8+T细胞表面mCD100水平降低，可能与AHB患者外周血基质金属蛋白酶-1水平升高，促进mCD100脱落有关［11］；反之，慢性HBV感染则使血浆sCD100水平下降，CD8+T细胞表面mCD100水平升高。提示不同HBV感染状态可导致mCD100和sCD100表达模式改变，可能与CD100在免疫细胞膜表面从表达到脱落的时间半衰期在AHB和CHB中不同有关。慢性HBV感染可能通过抑制免疫细胞表面mCD100脱落导致mCD100水平升高，而发挥生物学活性的sCD100水平降低，无法有效维持和诱导免疫细胞的杀伤活性，导致感染慢性化。

在口腔扁平苔藓中，CD100可通过诱导趋化因子CXCL9/CXCL10表达诱导CD8+T细胞向病变部位募集和浸润［12］。在HBV高压尾静脉注射小鼠模型中，重组CD100可通过活化树突状细胞和肝血窦内皮细胞增强T细胞功能［4］。由于CD8+T细胞存在CD100的受体CD72，因此，推测CD100在HBV感染中可能直接调控CD8+T细胞功能［4，9，13］。AHB患者CD8+T细胞功能增强，CHB患者CD8+T细胞功能衰竭［14-15］。结合本研究发现的AHB患者sCD100水平升高，而CHB患者sCD100水平降低，本研究主要观察CD100对CHB患者外周血CD8+T细胞功能的调控作用，CD8+T细胞既可通过穿孔素-颗粒酶B途径、依赖细胞接触直接杀伤靶细胞，还可通过分泌细胞因子、不依赖细胞直接接触诱导靶细胞凋亡［16］。本研究发现，CD100不但可促进CHB患者CD8+T细胞分泌穿孔素和颗粒酶B，还可提升IFN-γ和TNF-α表达水平，进一步采用直接接触和间接接触培养系统证实CD100对CD8+T细胞的直接杀伤和非细胞杀伤活性，发现CD100刺激后CD8+T细胞通过分泌细胞因子介导的靶细胞凋亡并未明显增加，而依赖细胞接触的直接细胞杀伤功能显著增强。说明CD100介导的CD8+T细胞分泌细胞因子增加并不足以杀伤靶细胞，而CD100主要通过提升CHB患者CD8+T细胞的直接杀伤活性发挥细胞毒性作用。慢性HBV感染者中sCD100表达减少无法有效维持CD8+T细胞功能，导致CD8+T细胞功能障碍甚至衰竭。但mCD100可表达于多种免疫细胞（T细胞、B细胞、单核细胞、自然杀伤细胞等）表面，外周血中的sCD100可来源于上述多种免疫细胞膜表面mCD100脱落，因此CD100在其他免疫细胞中的调控作用有待进一步研究。

总之，HBV感染可改变mCD100和sCD100表达模式变化，尤其是在慢性HBV感染中，CD8+T细胞表面mCD100脱落受抑制，导致CD8+T细胞mCD100表达升高及外周血中sCD100水平降低，导致CD8+T细胞功能障碍和机体免疫耐受，诱导HBV感染慢性化。