线性泛素化修饰对免疫系统的调控作用研究进展①

张 勇 张令强 刘翠华 （中国科学院微生物研究所病原微生物与免疫学重点实验室，北京100101）

作为一种重要的蛋白质翻译后调控机制，泛素化修饰在炎症、免疫、感染、肿瘤、神经退行性疾病等多种生理和病理过程中发挥重要的调控作用［1］。泛素化修饰是由76个氨基酸残基组成的泛素分子经E1泛素激活酶、E2泛素耦合酶以及E3泛素连接酶三步催化反应连接到底物蛋白上的过程，可调节底物蛋白的稳定性、活性以及生物学功能。E1激活并将泛素分子转移到E2，而E3通过选择性招募底物蛋白并将E2上的泛素分子转移到底物蛋白上形成泛素链，E1、E2和E3共同作为泛素书写器（writ‐er）催化泛素化修饰的产生［2］。泛素化修饰是动态、可逆的过程，去泛素化酶（DUBs）可作为擦除器（eraser）水解底物蛋白上的泛素链，反向调节底物蛋白的生物学功能［3］。此外，多种含泛素结合结构域（ubiquitin-binding domains，UBDs）的蛋白可作为阅读器（Reader）识别泛素化修饰产生的泛素信号［4］。泛素书写器、擦除器以及阅读器作为泛素系统的重要组分共同维持泛素系统稳态平衡并进而调节一系列重要生物学功能。

人类泛素系统包含2种E1、约40种E2、超过600种E3、约100种DUBs以及20多种UBDs。根据E3特定结构域以及催化泛素分子转移到底物蛋白上的方式，可以将其分为三种类型：RING（really in‐teresting new gene），HECT（homologous to the E6AP carboxyl terminus）以 及RBR（RING-in-between-RING）［5］。人类基因组中包含约600种RING型E3、28种HECT型E3以及14种RBR型E3。RING型E3含有典型的能结合锌的RING或者U-box结构域，能通过单体或二聚体结合Ub-E2并将E2上的泛素分子直接转移到底物蛋白上。HECT型E3含有保守的HECT结构域，通过其HECT结构域的氨基端与Ub-E2结合并催化泛素分子转移到其羧基端的半胱氨酸残基上，再将泛素分子转移到底物上。RBR型E3含有RING1、RING2以及IBR（in-between-RING）结构域，RING1能结合E2-Ub并催化泛素分子转移到RING2上的半胱氨酸残基上，再将泛素分子转移到底物蛋白上完成泛素化修饰过程［6］。泛素系统以其编码信号的复杂性和多样性广泛参与对生命活动不同阶段的调节，并通过不同的调节机制严格调控多种生物学过程。泛素分子在E3的催化作用下能发生单泛素化和多聚泛素化修饰。多聚泛素化修饰根据其形成泛素链的氨基酸残基可以分为8种不同的 类型（M1、K6、K11、K27、K29、K33、K48、K63）［7-8］。不同类型的泛素链之间能以多种组合类型形成混合泛素链。而泛素分子本身的活性也可以被其他类型的翻译后修饰所调节，如磷酸化、乙酰化和苏木化等。不同类型的泛素化修饰决定了底物蛋白的不同命运［9-10］。例如，K48泛素化修饰通常作为降解信号促进底物蛋白通过蛋白酶体降解，而K63泛素化修饰则主要调控底物蛋白的活性。不同于赖氨酸（lysine，K）介导的泛素链形成，线性泛素化修饰是泛素分子通过第1位的甲硫氨酸与另一个泛素分子第76位的甘氨酸相连形成多聚泛素链的一种新型多聚泛素化修饰类型［11］。细胞中的线性泛素链约占所有泛素链的0.5%。果蝇中鉴定出的LUBEL（linear ubiquitin E3 ligase）也具有线性泛素酶活性［12］，提示线性泛素化修饰在进化上高度保守。越来越多的研究表明线性泛素化修饰在免疫系统中发挥重要的调控作用。本综述总结了线性泛素化修饰的产生、去除、识别和调节的分子机制，及其在机体免疫应答（包括天然免疫和适应性免疫）和病原免疫逃逸过程中的调控作用，旨在促进对线性泛素化修饰在生理病理过程中的重要生物学功能的认识和深入研究，并为靶向该修饰过程的感染和免疫性疾病防治提供新思路。

1 线性泛素化修饰概述

线性泛素链最初被认为是多聚泛素基因UBB和UBC的翻译产物。直到2006年，KIRISAKO及其同事证明了线性泛素链能被由HOIL-1L（haem-oxi‐dized irp2 ubiquitin ligase-1）和HOIP（HOIL-1L inter‐acting protein）组成的线性泛素链组装复合体（linear ubiquitin assembly complex，LUBAC）催化产生［13］。LUBAC能利用多种类型的E2耦合酶如UbcH7和UbcH5s催化线性泛素链的产生。SHARPIN（SHANK-associated RBCK1 homology-domain-inter‐acting protein）随后被证明是组成LUBAC复合体的第三个蛋白亚基［14-15］。值得注意的是，LUBAC是目前唯一已知的能催化线性泛素链产生的泛素连接酶。随后，OTULIN（OTU deubiquitinase with linear linkage specificity）和CYLD（cylindromatosis）相继被报道具有去线性泛素化酶活性。此外，多种蛋白结构域被报道能特异性识别线性泛素链（图1）。而线性泛素化酶活性以及线性泛素链稳态平衡也受到LUBAC组分、去线性泛素化酶以及不同翻译后修饰的多重调控。

1.1 线性泛素链组装复合体 线性泛素链组装复合体LUBAC由催化亚基HOIP和调节亚基SHARPIN、HOIL-1L组成。凝胶过滤层析实验表明HOIP、HOIL-1L和SHARPIN三个亚基相互作用可以组成分子量为600 kD的复合体。每个亚基蛋白稳定性的改变都会影响复合体的形成和组装，如小鼠成纤维细胞中SHARPIN的缺失会降低HOIP和HOIL-1L的蛋白稳定性。同样的，HOIL-1L常染色体阴性遗传患者来源的成纤维细胞中HOIP和SHARPIN的蛋白稳定性也会降低［15］。线性泛素链在生理过程中发挥着极其重要的作用。例如，SHARPIN敲除小鼠会表现出明显的慢性增生性皮炎和二级淋巴器官缺陷［16］，HOIP敲除小鼠会在胚胎期10.5 d因卵黄囊血管发育缺陷而导致胚胎致死［17］，而HOIP亚等位基因突变和HOIL-1L的截短突变都会导致严重的自身炎症、免疫缺陷以及肌肉支链淀粉病［18］。

图1 线性泛素链的产生、识别和去除Fig.1 Generation，recognition and removal of linear ubiquitin chains

HOIP和HOIL-1L都属于RBR家族的泛素连接酶，而SHARPIN不具有泛素连接酶活性。HOIP的RBR结构域在线性泛素链产生过程中发挥重要作用，而其特有的LDD（linear ubiquitin chain-determin‐ing domain）结构域决定了泛素分子之间可以形成线性泛素链［19］。HOIP首先通过RING1结构域结合E2-Ub，并将该泛素分子转移到RING2结构域上与Cys885形成硫酯键，然后通过其C端的LDD结构域促进该泛素分子与另一泛素分子以首尾相连的方式形成线性泛素链。HOIL-1L虽然也具有RBR结构域，但主要催化底物蛋白上丝氨酸和苏氨酸以氧酯键形成的单泛素化修饰［20］。在催化亚基HOIP单独存在的情况下，其RBR-LDD催化活性可被UBA结构域所抑制，尽管UBA结构域和RBR-LDD结构域之间的直接相互作用并没有被检测到。此外，研究还表明，UBA结构域的缺失能释放HOIP的催化活性。当调节亚基HOIL-1L和SHARPIN通过其泛素样（ubiquitin-like，UBL）结构域结合到HOIP的UBA结构域时，能解除HOIP的自抑制状态，从而促进线性泛素链组装复合体的催化活性［21-22］。然而，到目前为止，HOIP自抑制状态的结构仍未被解析。LUBAC复合体各组分之间的相互调节及其发挥催化活性的作用机制仍有待进一步深入研究。

1.2 去线性泛素化酶 去泛素化酶在维持泛素系统稳态平衡中起着至关重要的作用。人类基因组中去泛素化酶可分为7种不同的类型，包括USP（ubiquitin-specific proteases）、OTU（ovarian tumor）、MJD（machado-joseph disease）、UCH（ubiquitin C-ter‐minal hydrolases）、MINDY（MIU-containing novel DUBfamily）、JAMM（JAB1/MPN/MOV34 metallopro‐tease DUBs）以及ZUP1（zinc finger-containing ubiqui‐tin peptidase 1）［23］。其中，OTULIN（OTU家族）和CYLD（USP家族）是目前已知的两种能切割线性泛素链的去泛素化酶。OTULIN是唯一已知的能特异性切割线性泛素链的去泛素化酶［24］。在所有的8种泛素链型中，K63泛素链与线性泛素链的空间结构最相似，而OTULIN与线性泛素链的结合能力是K63泛素链的100倍。OTULIN定位在细胞质中，通过其PIM结构域与HOIP的PUB结构域相互作用，从而抑制LUBAC对自身的线性泛素化修饰。已有研究表明，表达OTULIN酶活突变体的细胞表现出更高水平的线性泛素化修饰，同时会诱导细胞死亡复合体Ⅱ的形成，从而对TNF诱导的细胞死亡更敏感。OTULIN在维持机体稳态平衡中也发挥着至关重要的作用。例如，有研究表明，OTULIN基因突变会导致以反复发烧、腹泻、脂膜炎、关节炎和自身抗体产生为特征的早发型自身炎症综合征ORAS（OTULIN-related autoinflammatory syndrome），而OTULIN敲除小鼠会因血管发育缺陷而在胚胎期12.5 d发生胚胎致死［25］。值得注意的是，OTULIN既能通过酶活性依赖的方式调控机体稳态平衡，也能以酶活性非依赖的方式发挥作用。因此，需结合特定的疾病模型以及在疾病发展的不同阶段探究OTULIN的具体功能和作用机制。

CYLD最初被鉴定作为圆柱瘤的肿瘤抑制因子。CYLD基因缺陷会导致毛发上皮瘤，其体细胞突变会导致乳头状瘤病毒相关的头颈癌［26］。而CYLD单等位基因突变会导致皮肤性肿瘤易感综合征［27］。CYLD被报道能水解K63和M1多聚泛素化链，但不水解K48多聚泛素链，并且对K63和M1泛素链具有相同的切割活性［28］。与OTULIN不同的是，CYLD并不直接与HOIP相互作用，而是依赖SPATA2（PIM-containing spermatogenesis-associated 2）与HOIP互作。CYLD通过其USP结构域结合SPATA2的PUB结构域，而SPATA2通过其PIM结构域结合HOIP的PUB结构域，从而形成CYLD-SPA‐TA2-LUBAC复合体［29］。有趣的是，OTULIN和STA‐PA2能竞争性结合HOIP的PUB结构域。与OTU‐LIN不同的是，SPATA2-CYLD并不会影响LUBAC的自泛素化过程［30］。研究表明，OTULIN的缺失会诱导细胞内线性泛素化丰度增加，而CYLD缺失则不会影响细胞内线性泛素化水平［31］，因此CYLD可能通过发挥泛素链编辑功能调节K63-M1杂合泛素链的产生。

1.3 线性泛素链结合结构域 不同类型的泛素链除了能调节底物蛋白的稳定性、活性以及亚细胞定位外，还能作为支架招募特异识别泛素链的互作蛋白。这些互作蛋白具有特异的泛素结合结构域，能在特定刺激条件下被产生的泛素链所招募，调节泛素信号依赖的生物学功能。已有研究报道多种不同类型的结构域能识别并结合线性泛素链，包括UBAN（ubiquitin-binding in ABIN and NEMO）、ZF7和NZF。多种蛋白含有UBAN结构域，包括NEMO、OPTN（optineurin）、ABIN-1、ABIN-2和ABIN-3［32］。根据已被报道的NEMO、OPTN以及ABIN-2与线性泛素链和K63泛素链的复合体结构，NEMO蛋白UBAN结构域与线性泛素链的亲和力是K63泛素链的100倍。线性泛素链近端和远端Ile44和Phe4的疏水区对UBAN的结合是至关重要的。NEMO的UBAN结构域能促进线性泛素链招募IKK复合体，从而诱导经典NF-κB信号的激活［33-34］。此外，研究表明NEMO中UBAN结构域的错义突变会导致X连锁无汗性外胚层发育不良伴免疫缺陷，表明NEMO的线性泛素链结合能力在机体免疫稳态维持中发挥重要的作用［35］。

OPTN被报道参与NF-κB信号激活、抗病毒感染、囊泡运输以及选择性自噬等多种细胞功能的调节。OPTN具有和NEMO相似的结构域，但不与IKKα/β相互作用。OPTN-UBAN能选择性结合线性泛素链，并且对线性泛素链具有高度的亲和力（解离常数Kd=1.0μmo/lL）［36］。蛋白复合体结构数据表明人源的OPTN通过二聚体与两分子的线性泛素链结合，而鼠源的OPTN形成泛素链后只结合一分子的线性泛素链［36-37］。OPTN-UBAN在维持机体稳态过程中也发挥重要的作用。研究表明，OPTN的缺失会诱导RIPK1依赖的细胞坏死，同时会导致肌萎缩侧索硬化症的发生［38］。OPTN-UBAN的E478G错义突变会彻底废除OPTN与线性泛素链的结合能力，从而引起肌萎缩侧索硬化症。

锌指（zinc finger，ZF）结构域是多种泛素结合蛋白都含有的一类重要结构域，但并不是所有的ZF结构域都能结合线性泛素链。A20是一种能水解K48和K63泛素链的去泛素化酶，能以去泛素化酶活性非依赖的方式抑制LUBAC介导的NF-κB激活，由N端的OTU结构域以及七个锌指结构域（ZF1-ZF7）组成［39］。其中，ZF7被报道能结合线性泛素链。尽管A20-ZF7结构域只含有约30个氨基酸，但与线性泛素分子形成的疏水界面保证了其能以高亲和力和高特异性与线性泛素分子，而不是单泛素或者K63泛素分子结合（Kd=9μmo/lL）［15］。A20-ZF7与线性泛素分子的作用模式表明ZF结构域能以一种不直接结合泛素连接区的方式选择性地识别线性泛素链和K63泛素链。此外，HOIL-1L作为LUBAC的调节亚基，除了可以被线性泛素化修饰外，还具有能结合线性泛素链的NZF（Npl4-type zinc finger）结构域。研究表明，相比于单泛素、K48泛素链以及K63泛素链，NZF结构域对线性泛素链具有更高的结合能力（Kd=20μmo/lL）。NZF结构域也存在于TAB2/3蛋白上，但与HOIL-1L-NZF不同的是，TAB2/3-NZF只能特异性结合K63泛素链。尽管这两种NZF结构域在结构上很相近，但对远端泛素的识别能力上存在显著差异。TAB2/3-NZF主要识别远端泛素分子的I44疏水界面，而HOIL-1L-NZF通过其C端的α螺旋识别F4疏水区，这种与远端泛素分子结合的能力也就导致了两种NZF在泛素链识别上的差异性［40］。

1.4 线性泛素化复合体的调节机制 作为多个蛋白亚基组成的复合体，LUBAC的泛素连接酶活性受到蛋白-蛋白相互作用以及翻译后修饰等多种不同机制的严格调控。已有研究表明，HOIP的UBA结构域和HOIL-1L以及SHARPIN的UBL结构域的相互作用对三聚体LUBAC复合体的形成是必需的，HOIL-1L或SHARPIN的缺失会导致LUBAC复合体不稳定。OTULIN不仅能特异性去除线性泛素链，还能通过与HOIP相互作用调节LUBAC的催化活性。研究表明，OTULIN能通过其氨基端的PIM结构域与LUBAC形成复合体，从而抑制LUBAC对底物的催化作用［41-42］。同时，OTULIN-LUBAC的相互作用也受到PIM结构域中Tyr56磷酸化修饰的调控。OTULIN Tyr56磷酸化修饰会降低其与LUBAC的相互作用，从而促进LUBAC的催化活性。同时Tyr56磷酸化会增强OTULIN与β-catenin的相互作用，从而促进Wn/tβ-catenin信号的激活［43］。此外，MST1（mammalian Ste20-like kinase 1）激酶能通过磷酸化HOIP反向调节TNF-α诱导的NF-κB信号激活［44］。TRIM32能作为OTULIN的泛素连接酶，通过促进OTULIN的泛素化修饰阻止OTULIN与LUBAC的相互作用，从而促进NF-κB信号的激活［45］。OTU‐LIN能被caspase-3剪切从而抑制细胞凋亡，而DUSP14（dual-specificity phosphatase 14）则作为磷脂酶通过将OTULIN Tyr56去磷酸化从而抑制细胞坏死［46］。E3泛素连接酶HOIL-1L能将LUBAC三个亚基单泛素化并促进LUBAC的自线性泛素化修饰，从而抑制LUBAC的功能［47］，而线性泛素化复合体在不同疾病模型中的调节机制仍有待深入研究。

2 线性泛素化修饰在天然免疫反应中的调控作用

天然免疫系统以其动态有序、精密调控的免疫细胞和信号分子产生的免疫应答反应构成了维持机体稳态平衡以及抵抗病原感染的重要防线。作为重要的翻译后修饰，泛素化修饰能以多种不同的调节机制精细调控天然免疫信号网络以及免疫细胞的激活、反应和失活过程。线性泛素化修饰最初被报道参与TNF介导的NF-κB信号激活，随后的研究表明线性泛素化修饰在细胞死亡、NOD样受体信号通路激活、干扰素信号通路激活和细胞自噬等天然免疫相关的细胞生物学过程中也发挥重要的调控作用。

2.1 NF-κB信号通路激活 NF-κB转录因子在天然免疫反应中发挥重要作用。静息状态下，NF-κB被IκBα滞留在胞质中。多种受体的激活都能活化NF-κB信号，包括TNFR（tumor necrosis factor recep‐tor）、IL-1R（interleukin-1 receptor）和TLR（toll-like re‐ceptor）等［48］。TNF-α 结合到TNFR1受体上会导致TNF-RSC（TNFR1 signaling complex）的形成和寡聚，随后，TRADD（TNFreceptor-associated death domain）和RIPK1（receptor-interacting protein kinase 1）分别被招募到TNF-RSC。TRADD可以充当信号平台招募TRAF2/5（TNF receptor-associated factor 2/5）和E3泛素连接酶cIAP1/2（cellular inhibitor of apopto‐sis1 and 2）。LUBAC在TNF刺激过程中会被cIAP1/2催化产生的K63多聚泛素链招募到TNF-RSC，催化RIPK1和NEMO（NF-κB essential modulator）发生线性泛素化修饰。随后，线性泛素链可以作为支架招募由IKKα、IKKβ以及调节亚基NEMO组成的IKK复合体。有趣的是，NEMO与线性泛素链的高亲和力会促进IKK复合体的聚集以及IKKβ的激活［49］。IKKβ随后会促进IκBα的磷酸化和K48泛素化降解，引起NF-κB入核促进炎症因子的表达。同时，LUBAC介导的NF-κB信号也受到多种因子的调控，如MST1（mammalian Ste20-like kinase）可被TRAF2招募到TNFR上抑制LUBAC的催化活性，PACRG（parkin-coregulated gene）可代替SHARPIN稳定LU‐BAC复合体［50］。IL-1β也是能激活NF-κB信号通路的重要促炎因子。IL-1β刺激会促进IRAK1（inter‐leukin 1 receptor-associated kinase 1）和IRAK4的K63/M1杂合泛素化修饰从而诱导NF-κB信号通路的激活［51］。因此，LUBAC在不同的刺激条件下可以通过多种机制调控NF-κB信号通路的激活。

2.2 细胞死亡 TNF-α诱导的NF-κB靶基因表达在抑制细胞凋亡中发挥重要作用。当NF-κB靶基因的表达受到抑制，如蛋白合成抑制剂放线菌酮和TNF-α联用可以通过促进由RIPK1、FADD和cas‐pase-8组成的Ⅱ型TNFR复合体的形成诱导细胞凋亡。而caspase-8可以通过激活caspase-3诱导外源性细胞凋亡，同时激活的caspases会切割LUBAC催化亚基HOIP的氨基端。当TNF-RSC的形成受到扰乱时，TNFR的激活会导致Ⅱ型TNFR复合体介导的细胞死亡，而不是诱导NF-κB信号激活［52］。而LUBAC介导的RIPK1的线性泛素化修饰可以抑制Ⅱ型TNFR复合体的形成和细胞死亡［53］。在小鼠模型中，LUBAC亚基的缺失会引起NF-κB靶基因表达减少，从而导致细胞凋亡。研究表明，TNF或TNFR的敲除能极大缓解SHARPIN缺失导致的慢性增生性皮炎，而对SHARPIN缺失导致二级淋巴器官缺陷没有影响，表明TNF-α诱导的细胞凋亡在SHARPIN缺失引起的慢性皮炎中发挥重要作用［54］。随后的研究表明，caspase-8和RIPK3的双敲小鼠能彻底缓解SHARPIN缺失导致二级淋巴器官缺陷。Myd88的敲除也能缓解SHARPIN缺失导致的皮肤损伤和慢性炎症［55］。由于线性泛素化修饰在多个炎症免疫信号通路中发挥重要调控作用，因此，线性泛素化修饰对细胞死亡的调节可能是多信号共同作用的结果。此外，线性泛素化修饰在不同类型细胞中对细胞死亡的调节方式也存在差异，仍需更深入的研究进一步揭示该修饰对细胞死亡的具体调控机制。

2.3 NOD样受体信号通路激活 作为重要的模式识别受体，NOD样受体（nucleotide-binding and oligo‐merization domain-like receptors，NLRs）构成了宿主抵御病原菌感染的第一道防线。其中，NOD1主要识别肽聚糖中的D谷氨酰内旋二氨基庚二酸（D-glutamyl-meso-diaminopimelic acid，iE-DAP），而NOD2能感知并被组成肽聚糖的胞壁酰二肽（mur‐amyldipeptide，MDP）所激活。NOD1/2被激活后能通过活化NF-κB信号通路促进炎症因子TNF-α和IL-6的产生。作为NLRs受体家族的重要成员，NL‐RP3能与ASC、pro-caspase-1组装形成炎症小体，在PAMPs或DAMPs刺激条件下激活caspase-1引起细胞焦亡和炎性细胞因子IL-1β和IL-18的成熟和释放［56］。研究表明，泛素连接酶XIAP（X-linked inhibi‐tor of apoptosis）能将RIPK2泛素化并招募LUBAC促进NOD2信号通路的激活，而当XIAP突变导致RIPK2不能被泛素修饰，丧失招募LUBAC的能力时则会引起二型X染色体关联的淋巴细胞增生综合征［57］。此外，在NLRP3炎症小体的组装和激活过程中，LUBAC能通过将ASC线性泛素化修饰从而促进NLRP3炎症小体的组装。LUBAC组分的缺失会减弱NLRP3炎症小体的激活，但对AIM2炎症小体的激活则不是必需的［58］。而线性泛素化修饰在其他NOD样受体激活过程中的作用机制仍有待进一步的研究。

2.4 干扰素信号通路激活 在天然免疫反应中，病原相关分子模式（pathogen-associated molecular patterns，PAMPs）被模式识别受体（pattern-recogni‐tion receptors，PRRs）识别后会激活NF-κB和Ⅰ型干扰素信号通路。胞质RNA主要被包括RIG-Ⅰ、MDA5以及LGP2在内的RIG-Ⅰ样受体（RIG-Ⅰ-like receptors，RLRs）所感知。RIG-Ⅰ和MDA5能通过MAVS激活抗病毒Ⅰ型干扰素信号通路，从而诱导Ⅰ型干扰素信号通路的激活。随后，Ⅰ型干扰素会结合多种细胞表面广泛表达的干扰素受体IFNAR1/2（IFNα/βreceptors），通过JAK（Janus kinase）激酶招募并激活STAT1/2（signal transducer and activator of transcription 1/2），从而诱导抗病毒基因（IFN-stimu‐lated genes，ISGs）的表达。已有研究表明，LUBAC能通过促进TRIM25的线性泛素化修饰，而HOIL-1L能通过与TRIM25竞争性结合RIG-Ⅰ从而抑制RIG-Ⅰ介导的干扰素信号激活［59］。此外，NEMO的线性泛素化修饰能干扰MAVS-TRAF3复合体的形成，从而抑制RIG-Ⅰ信号通路［60］。然而，也有研究表明HOIL-1L能促进鼠诺如病毒诱导Ⅰ型和Ⅲ干扰素产生［61］。而在Ⅰ型干扰素诱导的信号通路中，LUBAC对STAT1的线性泛素化修饰阻止了JAK1对STAT1的招募，从而抑制JAK-STAT信号通路的激活［62］。因此，线性泛素化修饰在不同病毒感染或刺激条件下能通过不同的调节机制发挥重要的调控作用。

2.5 细胞自噬 自噬是细胞通过形成双层膜的囊泡结构清除胞质内的外源异物或自身受损和异常折叠的物质从而维持细胞稳态的重要生物学过程。细胞自噬的发生和完成受到多种复合体的共同调控，包括ULK复合体、Ⅲ型PI3K复合体和ATG2-WIPI复合体等。其中，ULK复合体由ULK1/2、ATG13、RB1CC1/FIP200以及ATG101组成，主要在自噬的起始阶段发挥作用［63］。研究表明，LUBAC能通过线性泛素化ATG13稳定ULK复合体，从而促进自噬的发生，而ATG13过度的线性泛素化修饰则会抑制自噬的成熟［64］，表明线性泛素化修饰在细胞自噬的发生和成熟过程中都发挥重要的调控作用。此外，受损的细胞器和入侵的病原都能通过自噬途径被选择性降解。研究表明，存在于细胞质中的沙门氏菌会被泛素化修饰并通过自噬途径被清除，进一步的泛素化修饰组学分析表明沙门氏菌感染会通过激活NF-κB信号通路促进CDC42和LUBAC的活性，并且多种泛素连接酶（包括parkin、smurf1、LRSAM1和LUBAC）都参与宿主对沙门氏菌的选择性自噬降解［23］。有关线性泛素链与其他泛素链在异源自噬（xenophagy）中的相互调节方式仍有待进一步的研究。

3 线性泛素化修饰在适应性免疫反应中的调控作用

NF-κB信号通路在淋巴细胞发育和抗原递呈细胞介导的适应性免疫反应中也发挥着重要的作用［65］。CD40是表达在抗原递呈细胞表面的TNFR超家族的重要成员，在适应性免疫反应的激活过程中发挥重要的作用。B细胞表面CD40分子被CD40L激活后会引起MAPKs和经典NF-κB信号的激活。有意思的是，SHARPIN敲除小鼠来源的B细胞在CD40L刺激下，经典NF-κB和MAPK信号的激活严重受损，而非经典NF-κB信号的激活则不受影响。与TNF系统类似的是，HOIP-HOIL-1L-SHARPIN复合体也会被cIAP1/2招募到CD40复合体上调节信号的激活，然而，CD40复合体上的线性泛素化修饰底物尚未被报道。

B细胞受体和T细胞受体介导的NF-κB信号激活依赖于CARMA1、BCL10和MALT1组成的复合体［66］。在小鼠B淋巴细胞中，LUBAC对IgM诱导的BCR通路没有显著的影响，然而LUBAC的活性对CD40介导的NF-κB信号通路激活以及B1细胞发育都很重要［67］。只有在B淋巴细胞系中，BCR诱导的NF-κB信号激活才依赖线性泛素链，在小鼠原代细胞中LUBAC的活性对BCR信号不是必需的。而线性泛素链在CD40诱导的NF-κB信号激活中则一直是需要的。B细胞中缺乏HOIP会严重损害抗体的产生并导致B1细胞功能障碍。相比之下，LUBAC活性对CD4+T细胞、CD8+T细胞、NKT（natural killer T cells）以及调节性T细胞（Tregs）的分化、存活以及稳态都是至关重要的。小鼠Tregs细胞缺乏HOIP会导致Treg功能缺陷、外周耐受以及致死性免疫损伤。LUBAC能以NF-κB信号依赖和非依赖的方式维持T细胞的分化和存活［68］。研究表明，HOIL-1L在T细胞受体介导的反应中能被半胱氨酸蛋白酶MALT1剪切［69］。LUBAC能通过促进CARMA1-BCL10-MALT1复合体中BCL10的线性泛素化修饰调节B细胞受体（BCR）和T细胞受体（TCR）诱导的NF-κB信号激活［66］。因此，线性泛素化修饰在适应性免疫反应中发挥着重要的调控作用。然而，仍需更进一步的研究揭示调控适应性免疫反应发生的线性泛素化修饰底物以及线性泛素化酶活性在适应性免疫应答中的具体机制。

4 线性泛素化修饰在病原免疫逃逸过程中的作用

如前所述，线性泛素化修饰在调节机体免疫系统功能及维持免疫系统稳态平衡中发挥着至关重要的作用。而在机体抵抗病原微生物感染的过程中，一方面，机体会启动免疫系统抵抗和清除病原以保护机体免于外来病原的侵染［70］；另一方面，病原会产生和分泌多种毒力因子通过模拟和劫持宿主免疫系统避免被机体免疫系统识别和清除［71］。线性泛素化修饰是一种宿主免疫系统的重要调节机制，因此，病原在与宿主长期博弈的过程中产生了一系列能靶向线性泛素化修饰过程的效应蛋白，通过调控线性泛素链依赖的免疫应答从而逃逸机体抗感染免疫反应。

最近有研究报道了嗜肺军团菌能产生特异性水解线性泛素链的去泛素化酶RavD。RavD能在感染过程中被存在于胞质中的嗜肺军团菌分泌，通过直接靶向NEMO抑制其线性泛素化修饰进而减弱感染诱导的NF-κB信号［72］。还有研究表明，线性泛素链能直接包裹伤寒沙门氏菌，通过招募NEMO和OPTN介导宿主炎症反应以及对病原菌的自噬清除［73］，而志贺氏菌可分泌具有E3泛素连接酶活性的效应蛋白IpaH1.4和IpaH2.5，通过促进HOIP和NEMO的K48泛素化降解、抑制线性泛素链介导的NF-κB信号通路激活［74］。此外，线性泛素链也能被病原劫持促进其在宿主细胞内的复制和扩增。猪繁殖与呼吸综合征病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）被报道能通过其编码的NSP1α和NSP11效应蛋白分别抑制LUBAC复合体的形成以及招募宿主细胞内的OTULIN促进NEMO的去线性泛素化过程，从而抑制NF-κB信号激活［75-76］。Epstein-Barr病毒（EBV）能通过其LMP1效应蛋白招募LU‐BAC，促进转录因子IRF7的泛素化修饰，从而减弱病毒感染诱导的干扰素反应［77］。乙型肝炎病毒（hepati‐tis Bvirus，HBV）能通过HBx招募LUBAC抑制RIG-IMAVS介导的干扰素信号激活［78］。丙型肝炎病毒（hepatitis Cvirus，HCV）能通过其NS3效应蛋白竞争性阻断LUBAC与NEMO的相互作用，从而抑制NF-κB信号的激活［79］。值得一提的是，致癌病毒则能利用线性泛素化修饰促进癌症的发生。例如，Ⅰ型人类T细胞白血病病毒（human T-lymphotropic virus 1，HTLV-1）被报道能通过Tax效应蛋白结合LUBAC促进NF-κB信号激活，而EBV能招募LUBAC促进NEMO和TRAF1的线性泛素化修饰进而诱导NF-κB信号激活和细胞增殖（图2）［80］。

5 展望

作为一种新型的多聚泛素化修饰，越来越多的研究报道了线性泛素化修饰在包括免疫系统在内的多种器官系统中的重要调控作用。线性泛素化修饰能通过精密调控重要免疫信号分子和免疫细胞的生物学功能来维持免疫系统在生理病理过程中的稳态平衡，而免疫系统稳态失衡会导致感染、癌症、自身免疫病和神经退行性疾病等免疫系统疾病的发生。目前对线性泛素化修饰的认识还很不全面，仍存在许多亟待解决的问题。例如，线性泛素化和去线性泛素化酶在生理病理过程中是否存在酶活性非依赖的生物学功能？线性泛素化相关复合体在疾病发生过程中的酶活性调节方式是怎样的？是否存在对线性泛素化复合体功能至关重要的新的调节亚基？线性泛素化修饰与其他翻译后修饰之间的相互调节方式？目前有关线性泛素化修饰的研究主要集中在炎症、感染和癌症等疾病，而其在自身免疫病和神经退行性疾病等免疫性疾病方面的调控功能及机制还远未明确。今后可利用蛋白质组和泛素化修饰组等多组学方法揭示组织特异性和不同病理条件下的线性泛素化修饰新底物，并进一步构建特定细胞类型敲除的小鼠模型和基因敲入小鼠模型，开发更多特异性识别线性泛素链的检测工具，同时结合临床病理样本和体外生化实验方法，深入探究线性泛素化修饰对免疫系统正常生理功能的调控作用及其在免疫系统功能异常导致的多种疾病发生发展过程中的动态调控功能和精细调控机制，从而为多种免疫相关性疾病的干预和治疗提供新思路和新策略。

图2 线性泛素化修饰对免疫系统的调控作用Fig.2 Regulatory roles of linear ubiquitination in im⁃mune system