天香丹减轻大鼠冠脉微血栓及调节Nrf2/ARE信号通路的机制❋

马学宽，古丽葛娜·萨吾尔，张 华，辛锦钰，王思静，安冬青,2△

(1. 新疆医科大学中医学院，乌鲁木齐 830011； 2. 新疆名医名方与特色方剂学重点实验室，乌鲁木齐 830011)

冠脉微循环障碍(coronary microcirculation dysfunction，CMD)是急性冠状动脉综合征及经皮冠状动脉介入治疗(percutaneous coronary intervention，PCI)围术期常见并发症。研究显示，CMD与冠脉无复流或慢血流存在关联且与患者预后密切相关，在心血管疾病的发生发展及转归中起着重要作用[1]。天香丹为临床运用30余年的名老中医经验方，前期研究表明能够抗自由基损伤，改善缺血再灌注后微循环障碍，减轻心肌缺血[2]。本研究向左心室内注射月桂酸钠制作大鼠冠脉微循环障碍动物模型，评估天香丹对大鼠冠脉微血栓的影响，检测核转录因子NF-E2 相关因子2 /抗氧化反应元件(nuclear factor erythroid-2-related factor 2 / antioxidant response element，Nrf2/ARE)信号通路相关因子的表达，探究其改善冠脉微循环障碍的机制，为临床应用提供理论依据。本动物实验已通过新疆医科大学第一附属医院动物伦理委员会批准(IACUC-20170222027)。

1 材料

1.1 动物

SPF级雄性SD大鼠36只，体质量(180±20) g，购自新疆医科大学动物实验中心，实验动物许可证号SYXK(新) 2018-003，饲养于新疆医科大学动物实验中心SPF级环境中。

1.2 药物

天香丹组成：红景天、新塔花、丹参、降香等，并由新疆华世丹药业有限公司制备(批号18091201，每袋9 g，含生药量3.125 g)；尼可地尔(批号N0837，上海梯希爱公司)。

1.3 试剂及仪器

戊巴比妥钠(批号P3761)，Sigma公司；月桂酸钠(批号BCBBV3875)，Sigma公司；苏木素(批号ZLI-9610)，中杉金桥公司；伊红(批号ZLI-9613)，中杉金桥公司；马休黄-酸性品红-苯胺蓝(批号G2040)，索莱宝公司；Nrf2(批号E-AB-33607)，伊莱瑞特公司；Keap1(bs-4648R)、NQO1(bs-23407R)，博奥森公司；正常山羊血清工作液(批号ZLI-9028)、兔SP试剂盒(批号SP-9001)，中杉金桥公司；DAB显色试剂盒(批号ZLI-9018)；飞利浦HD11XE超声诊断仪；泰盟HX-300S动物呼吸机，JEM-100CXII型透射电子显微镜。

2 方法

2.1 动物建模及分组

SPF级雄性成年SD大鼠27只，体质量180±20 g腹腔注射戊巴比妥钠40 mg/kg麻醉、备皮、消毒后气管插管以辅助通气。开胸暴露心脏及主动脉根部，使用一次性1 mL BD胰岛素针刺入左心室(以有回血为准)，迅速注入2 mg/kg月桂酸钠，同时夹闭主动脉升部与主动脉弓连接处10 s，关胸复苏、喂养。术中全程无菌操作，术后腹腔注射青霉素3 d预防感染。术后将存活下的手术大鼠随机分为模型组、尼可地尔组、天香丹组，并设空白对照组大鼠9只。

2.2 给药剂量

大鼠给药剂量g/(kg·d)=成人每日剂量(g)×大鼠体表面积/人体表面积[3]，天香丹组大鼠给予 0.9408(X)2/3g/d 天香丹颗粒灌胃。尼可地尔组给予 0.7840(X)2/3mg/d 尼可地尔溶入生理盐水中灌胃，X代表大鼠体质量kg；空白对照组、模型组给予每日灌胃生理盐水，每只大鼠给药体积均为2 mL/d。自大鼠术后第二天开始，每日给药 1 次，每周按体质量调整给药量，共给药28 d。各组大鼠均自由饮水饮食，不限制活动。

2.3 超声心动图检测

给药28 d后，在全身麻醉的状态下将其固定后行超声心动图检测。大鼠胸前区备皮，涂以耦合剂，超声探头对准胸部第3、4肋间扫描，以M型超声心动图连续测量 3 个不同心动周期左室舒张末期内径(left ventricular end-diastolic dimension,LVEDD)、左室收缩末期内径(left ventricular end systolic diameter,LVESD)并取平均值。按照公式左室射血分数(left ventricular ejection fraction,LVEF)=(左室舒张末期内径3-左室收缩末期内径3)/左室舒张末期内径3×100得到各组大鼠左室射血分数以评价心功能。

2.4 光镜检查

超声心动图检测完成后大鼠开胸取出心脏，修剪去除心耳及主要大血管，沿心脏中线切为一半，投入中性甲醛溶液中固定48 h。石蜡包埋后，将组织切成4 μm厚的切片，行HE染色及马休黄-酸性品红-苯胺蓝染色，观察微血栓的形成。

2.5 透射电镜检查

取大鼠心肌组织，4 ℃下修剪为约1 mm3的组织块，2.5%戊二醛固定液中固定24 h，经过脱水、渗透、包埋制成切片，染色后透射电镜下观察心肌细胞超微结构变化。

2.6 免疫组化检测

采用免疫组化法检测心肌组织中核转录因子NF-E2 相关因子2(nuclear factor erythroid-2-related factor 2，Nrf2)、Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白-1(Kelch-like ECH-associated protein-1，Keap1)、醌氧化还原酶1[NAD(P)H:quinone oxidoreductase 1，NQO1]的表达。一抗稀释倍数为Nrf 2(1:50)、Keap1(1∶50)、NQO1(1-50)。每组切片中任选1张作为阴性对照，使用 0.01 mol/L PBS代替一抗进行染色。每张切片随机选取5个视野，以细胞胞浆、胞质、胞核中出现黄色或棕褐色颗粒判断有阳性反应，采用Image pro plus软件进行分析。

2.7 统计学方法

3 结果

3.1 心功能检测

表1示，与空白对照组比较，模型组大鼠LVEDD、LVEF均降低(P<0.05)；与模型组比较，尼可地尔组LVEF升高(P<0.05)，天香丹组LVEDD、LVEF升高(P<0.05)，天香丹组与尼可地尔组LVEDD、LVESD、LVEF比较差异无统计学意义(P>0.05)。

表1 各组大鼠心功能比较

3.2 心肌组织病理学变化

图1示，HE染色结果显示，空白对照组未发现微血栓，偶尔可见少量红细胞。模型组大鼠冠脉微血管内分布着由红细胞、血小板和纤维蛋白构成的红色或白色血栓混合物，并可见心肌细胞纤维化。与模型组比较，尼可地尔组、天香丹组微血栓程度均有不同程度减轻，心肌排列正常。

图2示，马休黄-酸性品红-苯胺蓝染色显示，冠脉微血管内微血栓的成分多由红色纤维素和蓝色纤维蛋白组成。空白对照组未见微血栓，模型组栓塞程度较重，尼可地尔组及天香丹组微血管内血栓均有不同程度减轻。

注：a.空白对照组；b.模型组；c.模型组心肌细胞；d.尼可地尔组；e.天香丹组；f.天香丹组心肌细胞

3.3 透射电镜观察

图3示，空白对照组透射电镜图像可见心肌细胞排列整齐，结构良好。模型组可见心肌细胞闰盘间隙过大，心肌细胞破裂，线粒体絮状改变，内部复杂性降低，并可看到Z线明显不平。尼可地尔及天香丹治疗后减轻了线粒体损伤，心肌细胞排列较整齐，Z线略平，闰盘正常。

3.4 免疫组化检测

图4表2示，与空白对照组比较，模型组Keap1表达升高(P<0.05)；与模型组比较，天香丹组及尼可地尔组Keap1表达均降低(P<0.05)，天香丹组Nrf2、NQO1表达升高(P<0.05)。与尼可地尔组比较，天香组Nrf2、NQO1表达均升高(P<0.05)。

4 讨论

冠脉微循环障碍是指在多种因素的作用下，冠状前小动脉和小动脉结构与(或)功能异常所致劳力性心绞痛或心肌缺血的临床综合征[4]。研究发现，冠脉微循环障碍可表现为冠脉无复流、慢复流、X综合征、缺血再灌注损伤等[5-6]。月桂酸钠具有强烈的内皮损伤作用，可造成血管内皮的脱落甚至穿孔。本研究使用月桂酸钠作为内皮损伤剂行左心室内注射制作冠脉微循环障碍动物模型，更贴近临床病理生理实际情况[7]。

注：a.空白对照组；b.模型组；c.模型组心肌细胞；d.尼可地尔组；e.天香丹组；f.天香丹组心肌细胞

注：En.血管内皮(vascular endothelial)；Er.红细胞(red blood cell)；M.线粒体(mitochondrion)；Id.闰盘(intercalated disc)注：a.空白对照组；b.模型组；c.模型组闰盘；d.尼可地尔组；e.天香丹组；f.天香丹组闰盘

注：a.空白对照组；b.模型组；c.尼可地尔组；d.天香丹组

表2 各组大鼠心肌免疫组化染色中IOD值比较

心脏超声心动图检测LVEF值能够准确反映大鼠的心脏功能，在不使用侵入性方式或放射性示踪剂的情况下，超声心动图是非侵入性冠状动脉血流评估的替代方案之一[8-9]。本研究发现，模型组大鼠LVEF降低，尼可地尔组及天香丹组大鼠心功能恢复正常。结合文献及本研究结果，其可能的原因为冠脉微血管内出现微血栓，伴随心肌发生纤维化，心肌细胞缺血缺氧导致心功能降低。尼可地尔及天香丹能够改善心肌缺血，从而提高心功能[10-11]。

研究表明，Nrf2及其下游NQO1的表达上调是激活Nrf2/ARE信号通路的标志[12-14]。当发生过氧化时Nrf2与Keap1解偶联，解离的Nrf2进入胞核，激活Nrf2/ARE信号通路，调控下游抗氧化元件NQO1。NQO1能够还原醌类及其衍生物，阻止其产生活性氧并降低其毒性，从而减轻氧化应激反应[15-16]。中西药都可通过Nrf2/ARE信号通路发挥改善微循环障碍的作用。如齐欣[17]研究发现，益气活血药能通过激活Nrf2/ARE通路表达，并达到改善冠脉微循环障碍的作用。白雪思等[18]发现，川芎嗪联合卡波金通过上调Nrf2的磷酸化程度、下调Keap1的表达而发挥抗氧化作用，改善微循环障碍。本研究中，与模型组比较天香丹组Nrf2及其下游NQO1的表达增强，从而证实天香丹激活Nrf2/ARE信号通路。

冠脉微循环障碍属于中医学“胸痹”“真心痛”等范畴。研究发现，川芎嗪、麝香保心丸等中药提取物或中成药均能改善微循环，提高组织灌注水平[19-23]。天香丹为“通补开泄法”治疗冠心病的代表方。前期研究表明，可改善冠心病患者的胸闷、胸痛、心悸等症状[24]。本研究显示，冠脉微循环障碍发生时，微血管内出现微血栓，心肌超微结构发生改变。天香丹能够减轻月桂酸钠诱导的冠脉微血管内血栓程度，上调Nrf2、NQO1的表达，对Nrf2的负调控因子Keap1产生抑制作用。这可能与激活Nrf2/ARE信号通路有关。

本研究阐释了天香丹改善冠脉微血栓、提高心功能的机制，为天香丹防治冠脉微循环障碍提供理论依据。本研究还需进一步从天香丹是否调控Nrf2/ARE信号通路下游因子的表达，减轻氧化应激反应，而改善冠脉微循环障碍进行探讨。