动物类中药抗癌机制研究❋

吴 越，李贤煜，杨洪军

(1. 南京中医药大学药学院，南京 210000； 2. 中国中医科学院医学实验中心，中医药防治重大疾病北京市重点实验室，北京 100700； 3. 中国中医科学院中药研究所，北京 100700)

动物类中药的应用在我国有着悠久的历史，战国时期《山海经》[1]便有关于麝、鹿、犀、熊、牛等药用动物的记载。《本草纲目》共收载药物1892种，其中动物药461种[2]。清·唐容川在《本草问答》中论述“动物之功利，优甚于植物，以其动物之本性能行，而且具有攻性”[3]，指出了动物药的优越性。

据报道，中药材中抗癌作用确切的动物药有蜈蚣、全蝎、蚕蛹、蛇毒、蟾酥、土鳖虫、蛤壳、水蛭、牡蛎、蛤蚧、斑蝥、地龙等。对其进行梳理，有助于拓宽对动物药研究的新思路和新策略。本文将从动物类中药起效成分、抑癌机制方面进行阐述，并对其进行展望。

1 起效成分

动物类中药的成分主要包括蛋白质(酶)类、多肽类、生物碱类、黄酮类和甾体化合物类[4-5]，且多数为复杂混合物。从动物体内分离抗癌特异的活性物质是研究动物药的策略之一[6]。由于蛋白质、多肽等生物大分子结构复杂、分离获取较困难，于是科学家们将注意力转向了动物药小分子活性物质的分离与筛选。目前，仅有小部分动物药专属成分被确切分离到，如蝎毒[10]、蚕蛹多糖、华蟾素等[24](见表1)。

1.1 蛋白质及多肽组分

目前对于动物药中活性蛋白质和肽段的研究已经成为一个新的研究热点，如文蛤多肽、蜈蚣抗肿瘤蛋白等均有强烈的抗肿瘤活性，广泛应用于临床[39]。

表1 起效成分归纳和分类比较

蛤壳有清热利湿、化痰散结的功效，对肝癌、肺癌、胃癌、甲状腺肿瘤等有明显的抑制作用[16]。Wang等[15]通过研究文蛤中纯化的抗肿瘤多肽即文蛤多肽(Mere15)，发现其能抑制A549细胞生长，抑制率呈剂量和时间依赖性，且主要通过促凋亡与抗转移途径来抑制肿瘤生长，具有开发为治疗人肺癌多靶点治疗剂的潜力。

蜈蚣具有镇痛、中枢抑制、调节免疫、抗肿瘤等作用。Zhou等[12]发现，蜈蚣的醚提物和醇提物均可在小鼠体内抑制宫颈肿瘤的生长。Ma等[14]通过研究蜈蚣的乙醇提取物发现，其可诱导肿瘤细胞凋亡，可作为人类癌症潜在的治疗药物之一。张丽等[11]从蜈蚣中分离纯化得到较纯的蜈蚣抗肿瘤蛋白(CGⅠ)，对人宫颈癌细胞Hela和人胃癌细胞BGC-823有很强的体外抑制作用。

Zhan等[37]通过研究中华土鳖虫乙醇提取物(alcohol extracts of the centipede scolopendra subspinipes mutilans,AECS)发现，其可通过调节MAPK信号通路和相关转移因子发挥抗乳腺癌细胞增殖侵袭作用，可成为干预乳腺癌的潜在药物。Dai等[38]研究了土鳖虫提取物对肺癌细胞系A549细胞增殖的抑制作用,发现土鳖虫70%乙醇提取物有效，且可通过抑制血管生成从而抑制癌细胞生长。此外，王凤霞等[36]从土鳖虫新鲜雌虫体中分离纯化得到分子量约为72kDa的抗肿瘤活性蛋白成分，并命名为ESP72，发现其对人A549肺癌细胞也有抑制作用。

全蝎中含有蝎毒、核苷等活性成分，具有抗肿瘤功效。Emanuelly等[8]研究了蝎毒对宫颈癌细胞系的影响，发现其对HeLa细胞有细胞毒性作用。Wang等[40]发现，蝎毒多肽提取物可诱导体外培养的良性胶质瘤U251-MG细胞凋亡。

水蛭是破血逐瘀之良药。Lu等[29]发现，重组水蛭素能剂量依赖性地抑制HepG2喉癌细胞的黏附、迁移和侵袭且呈剂量依赖性。Guo等[31]发现，水蛭素能显著抑制凝血酶的活性，并抑制肿瘤的生长与转移。李先建等[27]发现，水蛭素能抑制肝癌HepG2细胞株的增殖、凋亡、迁移及侵袭。牟忠祥等[41]发现，水蛭素活性因子对S180肿瘤和鸡胚绒毛尿囊(CAM)新生血管具有较强的抑制作用。

牡蛎，也是历版中国药典收载的中医临床常用药。Zhong Ming等[18]研究了低分子量牡蛎多糖(low molecular weight oyster polysaccharide, LMW-OPS)，发现其能显著抑制肿瘤生长。Sakaguchi Kaito等[19]发现，牡蛎30%～50%乙醇提取物(ethanol precipitate of oyster extract, EPOE50)可增强NK细胞活性，同时EPOE50可能通过NK细胞活化抑制小鼠肿瘤的生长。Wang等[20]研究利用芽孢杆菌蛋白酶生产的富含寡肽牡蛎水解物，发现牡蛎水解物对小鼠产生了很强的免疫刺激作用，这可能激发其抗肿瘤活性。

蛤蚧即大壁虎，多项研究表明壁虎具有良好的抗肿瘤功能。Huang等[33]检测壁虎水提物对人肝癌细胞Huh7的影响发现，壁虎水提取物可抑制Huh7肝癌细胞生长并呈剂量与时间相关性。Kim等[34]通过研究壁虎中蛋白成分在人膀胱癌细胞5637中的抗肿瘤作用及其细胞机制，发现壁虎蛋白可诱导膀胱癌细胞凋亡，而对正常细胞没有任何细胞毒性作用。

蚕蛹作为一种常用的动物类中药，其应用有着悠久的历史。Li等[22]发现，蚕蛹蛋白水解物(silkworm pupa protein hydrolysate，SPPH)能特异性地抑制人胃癌细胞Sgc-7901的增殖并呈剂量与时间依赖性。

综上，蛋白质和多肽成分是动物类中药的独有组分，或许是其疗效区别于植物类中药的原因。但其在进行蛋白质纯化的过程中，部分试剂与操作会促使蛋白质的空间结构丢失，进而失去生物活性，那么究竟是否这些蛋白质或多肽发挥抑癌作用，还是仅有部分特殊位点发挥功能，亦或是其他成分？值得进一步研究与思考。

1.2 小分子化合物组分

中药中的小分子化合物组分主要包括甾体类、生物碱类、黄酮类、多糖类、砧烯类、脂肪族类、芳香族类。动物药中小分子类化合物往往具有成分明确、药效显著、作用机制清晰等特点。

全蝎中的蝎毒中含有有机酸、酯类及少量游离氨基酸。迄今为止，已经从蝎毒中分离出数十种蝎毒素单体[7]。蝎毒可以特异性阻滞钾离子通道, 其受体已被定位。氯离子通道在细胞膜信号传导中具有重要作用, 而蝎毒中提取的氯毒素(Chlorotoxin)是氯离子通道的特异性阻断剂[42]。

蚕蛹中的蚕蛹多糖具有多种药理作用[21]。王什等[43]检测蚕蛹中的多糖组分，发现随着多糖提取物浓度增加，人肝癌细胞SMMC-7721的Bax、p53蛋白表达均逐渐升高，而细胞Bcl-2蛋白的表达逐渐降低，得出蚕蛹多糖提取物具有一定抗肝癌活性的结论。

华蟾素是中华大蟾蜍的有效提取物，临床应用较为广泛，已有研究表明华蟾素具有明确的抗肿瘤作用[23]。Cheng等[24]对华蟾素及其主要活性成分蟾蜍灵进行了体外、体内和临床研究，发现其可以通过抗增殖、诱导凋亡、抗转移、抗血管生成、上皮-间质转化抑制、抗炎、Na+/K+-ATP酶活性靶向、类固醇受体共激活子家族抑制等多种途径抑制肿瘤的侵袭与迁移。Xiong等[25]发现，华蟾素可诱导人SGC-7901肿瘤细胞的凋亡。Li等[26]也发现，华蟾素可以通过细胞凋亡等多种途径发挥其抗肿瘤作用。

小分子类化合物有着其独特的优势，由于其清晰的化学结构可对其进行化学修饰与减毒增效，如去甲斑蝥素的合成大大降低了其毒性[47]。进一步寻找动物类中药中的小分子化合物，有助于进一步阐明动物药的抗肿瘤机制与作用靶点。

2 抑癌机制概述

动物类中药的成分复杂，其抑癌机制往往是多层次多靶点的。如蜈蚣乙醚提取物既可以诱导肿瘤细胞凋亡，又可以抑制癌组织新血管的生成[44-45]。现将目前动物类中药较为清晰的抑癌机制进行总结(表2)

2.1 诱导肿瘤细胞凋亡

细胞凋亡是一种细胞程序性死亡的形式，指机体有序有效地去除受损细胞，细胞凋亡在癌症的发生发展中具有重要作用。目前临床使用的大多数抗癌药物主要利用完整的凋亡信号通路来触发癌症细胞凋亡。因此，总结动物类中药组分对细胞凋亡的影响有广泛的生理和病理意义[51]。

Huang[33]发现，壁虎水提物能通过阻止LRP6与Frizzled6复合物的形成而抑制Wnt信号通路，从而抑制肝癌细胞的增殖、肿瘤球的形成及肿瘤干细胞的比例。Kim等[34]发现，壁虎蛋白可通过抑制Akt途径并激活内在Caspase途径，导致膀胱癌细胞的凋亡。郭梦丽等[32]发现，壁虎粗多肽(gecko crude peptides, GCPs)可通过下调VEGF-C(血管内皮生长因子C)、CXCR4(趋化因子受体4)、p-ERK1/2(细胞外调节蛋白激酶)、p-p38MAPK(磷酸化P38丝裂原活化蛋白酶)及p-Akt的表达水平而抑制HepG2(赫曼肝癌细胞)细胞的增殖与迁移，并诱导其凋亡。

Zhou等[12]发现，蜈蚣提取物可在小鼠体内抑制宫颈肿瘤的生长,可能是通过Bax和Caspase-3介导的线粒体信号传导途径诱导肿瘤组织的凋亡。Ding等[13]发现，蜈蚣提取物可通过阻止细胞周期G0-G1期，激活Caspase 9/3，下调bcl-2/bax蛋白比率以诱导肿瘤细胞凋亡。Ma等[14]发现，蜈蚣提取物可通过降低Bcl-2表达水平，升高Bak、Bax和Bad表达水平诱导A375细胞凋亡。孙婧[52]等研究发现，蜈蚣提取物具有显著抑制人肝癌HepG2细胞株增殖的作用且呈明显的量效关系。

Oliveira等[8]通过流式细胞术发现，蝎毒可诱导HeLa细胞的凋亡。Kampo Sylvanus等[9]通过研究东亚钳蝎抗肿瘤镇痛肽(buthus martensii karsch antitumor-analgesic peptide，BMK AGAP)对乳腺癌细胞干与上皮间质转化的影响，发现BMK AGAP通过NFκB(核因子κB)和Wnt/β-连环蛋白信号通路下调Ptx3的表达，抑制乳腺癌细胞的迁移和侵袭。Moradi等[10]发现，通过蝎毒治疗后的结肠癌细胞中，Bax(BCL2相关的X蛋白质)、Casp3(胱天蛋白酶3)和Trp53(细胞肿瘤抗原p53)显著过表达，肿瘤组织Bcl-2 mRNA水平下降，说明其对肠癌胞具有特异性抑制作用。贾莉等[46]采用东亚钳蝎毒(buthus martensii karsch, BMK)作为干预手段,发现其对Raji细胞具有生长抑制作用与诱导凋亡作用。

Li等[22]发现，SPPH能特异性地抑制人胃癌细胞SGC-7901的增殖，并以剂量与时间依赖的方式引起其异常形态特征。流式细胞术显示，SPPH能抑制S期细胞周期。此外，SPPH还能引起活性氧(ROS)的积累和线粒体膜电位的去极化，抑制Bcl-2表达，促进Bax表达，最终导致细胞凋亡。王什等[43]以蚕蛹中的多糖组分为研究对象，利用CCK-8法检测蚕蛹多糖提取物对人肝癌细胞SMMC-7721生长的抑制情况。Western blot检测细胞凋亡相关蛋白(Bax、Bcl-2和p53)的表达，结果表明蚕蛹多糖提取物对SMMC-7721细胞的增殖具有抑制作用且呈时间和浓度依赖性(P<0.01)。随着多糖提取物浓度增大，细胞Bax、p53蛋白的表达逐渐升高，Bcl-2蛋白的表达逐渐降低。

Wang等[15]通过研究表明，从文蛤中提取出的新型抗肿瘤多肽(Mere15)，可以通过促凋亡和抗转移途径抑制肿瘤生长。范成成等[32]发现，文蛤多肽处理后的肝癌细胞HepG2和胆管癌细胞QBC939的外形变化明显，并出现凋亡小体。通过检测细胞周期，经处理的肝癌细胞出现明显的凋亡峰，表明文蛤多肽可以诱导癌细胞凋亡。Wang等[16]发现，文蛤多肽作用后，肿瘤细胞G2/M期细胞比例逐渐升高，微管蛋白聚合受到抑制，表明文蛤多肽具有抑制肿瘤细胞增殖的作用，其作用机制与诱导细胞凋亡及细胞周期阻滞有关。

表2 动物类中药抗肿瘤作用机制概述

Lu等[29]发现，重组水蛭素通过调控Bcl-2和促凋亡蛋白Bad的方式，显著抑制HepG2细胞的生存力并诱导细胞凋亡。李先建等[27]将含不同浓度水蛭素的培养液作用于肝癌HepG2细胞，采用MTT法检测水蛭素对肝癌HepG2细胞增殖的影响，流式细胞法检测水蛭素对肝癌HepG2细胞凋亡的影响，发现HepG2细胞凋亡率、侵袭及迁移个数随水蛭素浓度增加而增加并呈浓度依赖性(P<0.05)。VEGF蛋白的表达量随水蛭素浓度增加而明显下调(P<0.05)，得出水蛭素能诱导肝癌HepG2细胞凋亡的结论。

Chi等[47]以羧甲基壳聚糖(carboxymethyl chitosan, CMCS)和去甲斑蝥素(norcantharidin, NCTD)为原料，通过酰胺化反应制备了新型聚合物药物(Novel polymer-drug conjugates, CNC)。CNC偶联物对胃腺癌细胞SGC-7901的增殖具有显著的抑制作用，并能抑制人脐静脉内皮细胞的迁移和成管。此外检测表明，与游离NCTD比较，聚合物更有效地触发sgc-7901细胞凋亡。进一步，CNC在balb/c裸鼠试验中对sgc-7901胃肿瘤的抑瘤率为59.57%，并显著降低毒性，增强了其体内抗肿瘤效果。同时研究发现，CNC可以通过上调TNF-α和Bax的表达，下调VEGF、Bcl-2、MMP-2和MMP-9的表达，抑制肿瘤转移，诱导肿瘤细胞的凋亡。Chen等[57]采用NCTD对鼻咽癌细胞系进行处理，显示细胞系中的胱天蛋白酶-3、胱天蛋白酶-8、胱天蛋白酶-9活化，抗凋亡蛋白Bcl-XL表达明显降低，促凋亡蛋白Bak表达增加，表明NCTD能明显促进鼻咽癌细胞的凋亡。

Li等[26]通过使用微阵列数据和计算机分析探讨华蟾素抗肿瘤机制，发现其很可能在MCF-7细胞中以类似咪康唑的方式发挥抗肿瘤作用。

何道伟等[48]分析了细蚯蚓提取物对Eca-109细胞生长抑制作用及机制，发现在细胞检测中有凋亡细胞出现，且细胞被阻滞在G0-G1期，DNA合成受阻，使肿瘤细胞受抑制，肿瘤体积缩小。

Sakaguchi Kaito等[19]实验结果表明，EPOE50增强NK细胞活性，抑制肿瘤的生长。李鹏等[10]通过研究牡蛎天然活性肽(bioactive peptides of oyster,BPO)对人胃腺癌BGC-823细胞凋亡的生物学效应，发现BPO-1对胃癌细胞具有显著的诱导凋亡作用。

诱导癌细胞凋亡是很多动物类中药所共有的抑癌机制。诱导癌细胞凋亡的途径有很多，报道最多的有两条：一是通过细胞膜上的死亡受体激活半胱氨酸蛋白酶诱导细胞凋亡；二是通过胞质内线粒体途径释放细胞凋亡因子(ICE, APaf-1, Bcl-2, Fas/APO-1)激活半胱氨酸蛋白酶诱导细胞凋亡。而动物类中药究竟通过哪条途径诱导细胞凋亡的还值得进一步探讨。

2.2 抑制肿瘤新血管生成

血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)是肿瘤血管生成因子(tumor angiogenesis factor, TAF) 重要的调控因子之一。肿瘤血管是肿瘤治疗的重要靶位。肿瘤细胞分泌高水平的促血管生成因子，有助于形成异常的血管网络，通过恢复肿瘤灌注和氧合使血管正常化，可以限制肿瘤细胞的侵袭性，提高抗癌治疗的效果[54-55]。

刘细平等[45]采用裸鼠Bel-7404人异位肝癌移植模型，以蜈蚣提取液灌胃31 d后，用免疫组化法对肿瘤组织标本进行血管内皮细胞生长因子VEGF和促血管生成素2(Angiopoietin 2, Ang-2)的检测发现，对照组VEGF与Ang-2的染色细胞数、染色强度及OD值均较治疗组多而强，差异均有统计学意义(P<0.01)，说明蜈蚣提取液能抑制裸鼠Bel-7404移植瘤的生长，且与抑制肿瘤血管生成有关。

Lu等[29]发现，重组水蛭素可以显著下调黏附与血管生成相关蛋白Fak和VEGF的表达，抑制肿瘤新血管生成。牟忠祥等[41]将水蛭素活性因子含药载体种植于鸡胚绒毛尿囊膜(chick chorioallantoic membrane, CAM)中，观察药物抑制新生血管的生长情况，并用计算机分析系统对CAM进行扫描发现，用药组血管分布稀疏、间距增大，含药载体周围血管减少；模型对照组则血管分布密集、间距缩小、呈放射状排列，说明水蛭素可以抑制新血管的生成。

大量研究报道，蛇毒组分可抑制血管生成[49]。Denise等[50]研究了蛇毒对各种类型癌细胞的抗肿瘤作用。从泡桐蛇毒中分离的去整合素样金属蛋白酶(Bothropoidin)，对人乳腺癌细胞Mda-mb-231具有抗肿瘤和抗血管生成作用。

曹付春等[35]通过免疫组织化学法检测地鳖纤溶活性蛋白(eupolyphaga sinensis walker fibrinolytic protein, EFP)对S180和H22荷瘤小鼠肿瘤组织的微血管密度(microvascular density, MVD)，细胞培养液中VEGF和碱性成纤维生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)的影响发现，EFP含药血清对人脐静脉内皮细胞、肺癌、乳腺癌细胞有显著抑制作用。ELISA法检测结果表明，EFP含药血清对人脐静脉内皮细胞、肺癌、乳腺癌细胞的VEGF和bFGF表达均有抑制作用。

VEGF能刺激肿瘤毛细血管的生长，为肿瘤增殖和播散提供条件，并已发现在多种肿瘤体系中过度表达[55]。目前很多动物类中药研究表明，可通过抑制VEGF的表达来抑制肿瘤新血管的生成，可为未来的进一步研究提供启示。

3 讨论与展望

目前对于动物类中药的抗肿瘤作用研究成果主要体现在以下几点。一是确定了一些新的有效成分并对其进行修饰。如去甲斑蝥素(NCTD)是中药斑蝥中发挥抗癌成分斑蝥素的衍生物，是由斑蝥素去除1、2位的2个甲基后人工合成，是具有世界领先地位的，能升高白细胞作用的新型抗肿瘤药物[47]；二是找到了一些新的中药抗肿瘤的通路和靶点；三是开辟了一些新的动物类中药研究方法。如SPME-GC-MS分析法等，均为动物类中药的研究提供了可行的方法。

但从现有的研究可以看出，动物类中药抗肿瘤作用研究还存在缺陷，诸如有效成分并不明确。动物药的成分复杂，种类繁多，目前的研究大多局限于动物药的溶剂提取物或含药血清体内体外实验中表现出的作用，并没有对其成分进行深入剖析；二是作用机制模糊。目前有大量研究报道，很多动物药都是通过诱导细胞凋亡发挥其抑癌作用，但是诱导细胞凋亡是适用于很多疾病治疗的普适性机制(如糖尿病[56]、肾脏病[57]、哮喘等[58])，并不是动物类中药发挥其抑癌作用的特有机制。且想要阐明动物类中药抑癌机制只从细胞凋亡层面论述显然不够。细胞凋亡作为一种细胞“表象”，其背后的作用机制和作用靶点需要进一步探讨；三是中药具有多靶点多层次的抗肿瘤作用，为后续的研究增加了难度；四是中药中的动物药虽然抗癌作用往往超出植物药，但是其毒性会对人体造成损伤，如蜈蚣、蛇毒等会造成毒性反应，故减毒增效是动物类中药的潜在研究方向；五是研究手段单一。目前对于动物类中药的研究手段主要采用MTT技术、CCK-8技术、细胞流式实验技术、Western Blot技术、划痕愈合技术等，用以检测动物类中药对癌细胞侵袭、迁移作用的影响，但并没有从生物整体水平和分子层面进行深度剖析，因此整合分析很有必要。

动物类中药具有成分复杂性、物质不稳定性、作用环节多样性等特点。近年来，运用组学策略从分子生物学水平研究疾病状态下基因、蛋白质、代谢产物等变化，找出药物的作用通路与作用靶点，在中医药的研究中已被广泛使用。运用组学的方法对动物类中药进行研究，运用整合分析策略，将可能为研究动物类中药的抗肿瘤机制开辟新思路。此外，还应充分参考生物药的研究手段，建立一套适用于动物类中药的研究方法。首先，应确定动物类中药的物质基础，充分利用技术的进步，将低温柱层析等先进分离手段应用在动物药的提取分离中。其次，应把目光聚焦到动物类中药中的肽类物质上。大量研究表明，某些特定的动物肽类物质是具有强烈生物活性的[59]，是动物类中药的重点起效成分。因此构建基于动物药肽库的高通量药物筛选模型，并确立一套健全的评价体系，将更加有助于动物类中药的开发与应用，为临床用药奠定基础。