化肝纤方联合恩替卡韦对慢乙肝肝纤维化患者的血清壳多糖酶3样蛋白1及临床疗效观察❋

牙程玉，蒋锐沅，胡 晓，吴 聪，毛德文

(1. 广西中医药大学，南宁 530001； 2. 广西中医药大学第一附属医院,南宁 530023)

肝纤维化是各种病因导致的慢性肝脏疾病向肝硬化进展的中间病理过程，其临床表现无特异性或差异较大，主要表现为肝区不适或胀或痛、疲倦乏力、食欲不振、大便异常等[1]。在我国，引起肝硬化及肝癌的主要原因是慢性乙型病毒性肝炎。据统计，全球肝硬化患者中，由乙型肝炎病毒(hepatitis b virus，HBV)引起的比例为60%[2]，而肝硬化转变为肝癌的5年发生率为5%～30%[3]，因此抗肝纤维化在延缓疾病进展中起着至关重要的作用。有研究显示，有效的病因治疗可逆转肝纤维化甚至早期肝硬化[4]。由此，肝纤维化的早发现、早诊断、早治疗对肝病患者来说无疑意义非凡。

迄今，肝纤维化诊断的“金标准”仍是肝脏穿刺活检，准确率可高达80%，但肝穿具有创伤性、患者难以接受、可重复率较低等问题，故临床上难以普及。近年来研究者们发现，血清中存在一种大小约40kDa的分泌型蛋白壳多糖酶3样蛋白1(chitinase-3-like protein 1，CHI3L1)，它可用于检测慢性乙肝患者的肝纤维化程度，并在肝脏中富集表达，比肾脏、心脏分别高出15.3、276倍[3]。有研究显示，血清CHI3L1浓度随肝纤维化的严重程度而逐步上升，并根据其表达水平可区分肝纤维化的不同阶段[5]。笔者运用CHI3L1的这一特点，以CHI3L1作为主要血清学评价指标，观察化肝纤方联合恩替卡韦治疗慢性乙型肝炎肝纤维化的临床疗效。

肝纤维化属于中医学“胁痛”“积聚”等范畴，其中“痰湿”“瘀血”是形成肝纤维化的关键性病理产物[6]。广西中医药大学第一附属医院肝病中心在肝纤维化治疗方面具有独到经验，在对肝纤维化病因病机深入研究的基础上研发了化肝纤方，该方是肝病中心积累多年经验用于抗肝纤维化的基本方，全方以豁痰化瘀、软坚散结为用，通过调整肝脏功能达到抗肝纤维化的目的。毛德文、胡振斌等通过观察化肝纤方治疗慢性乙型肝炎肝纤维化45例，表明化肝纤方在改善患者临床症状、肝功能及抗肝纤维化方面均具有较好的临床应用价值[7]。本研究已获得广西中医药大学第一附属医院伦理委员会批准，患者及家属签署知情同意书。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2018年1月至2018年12月广西中医药大学第一附属医院肝病科收治入院治疗的确诊为慢性乙型肝炎合并肝纤维化患者80例，以随机数字表法将患者分为2组各40例。治疗组40例，其中男21例，女19例,年龄36～59岁，平均年龄(48.2±8.4)岁。对照组40例，其中男23例，女17例，年龄35～63岁，平均年龄(48.3±6.2)岁。2组患者年龄、性别等一般资料比较差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。2组患者均按时完成整个疗程，无失访与脱落病例。

1.2 诊断标准

1.2.1 西医诊断标准 参照2015年由中华医学会肝病学分会和中华医学会感染病学分会共同制定的《慢性乙型肝炎防治指南(2015更新版)》[2]标准，参照2010年由中国中西医结合协会肝病专业委员会制定的《肝纤维化中西医结合诊疗指南》[1]标准。在慢性乙型肝炎的基础上出现肝区不适或胀或痛、乏力、食欲不振等临床症状；实验室检查：肝功能—丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase，ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(aspartate aminotransferase，AST)，两者均≤2.5倍正常值；AST/血小板比值(AST to platelet ratio index，APRI)<2；肝纤4项、肝脏硬度值(liver stiffness measurement，LSM)均符合上述肝纤维化指南中的诊断。

1.2.2 中医诊断标准 参照中国中西医结合协会肝病专业委员会制定的《肝纤维化中西医结合诊疗指南(2019版)》[8]中的标准：基本证型气阴虚损、瘀血阻络证，主症为神疲乏力，肢体倦怠，胁肋、少腹刺痛或胀痛，纳呆食少；次症可兼有口干而苦，时有恶呕、大便异常(便溏或大便干结)；舌脉：舌紫暗或有瘀斑瘀点，苔白或白腻，脉弦或弦涩。具备3项主症或2项主症伴随1项次症，同时结合舌脉，由两名副主任及以上级别医师判定。

1.3 纳入标准

符合上述诊断标准，年龄在18～65周岁之间，性别不限；患者均未经任何抗肝纤维化治疗，或既往接受过抗肝纤维化治疗但需经过4周洗脱期；Fibrosis 4 Score(FIB-4指数)：[FIB-4指数=(年龄×AST)÷(血小板×ALT1/2)]在2-4级病人；ALT、AST≤2.5倍正常值；总胆红素(Total bilirubin，TBiL)≤2.5倍正常值；乙型肝炎病毒DNA(hepatitis B virus-DNA，HBV-DNA)≤9×104IU/mL；体质量指数(Body Mass Index，BMI)<28 kg/m2(BMI=体质量/身高的平方，单位kg/m2)；依从性良好，自愿接受本治疗方案并签署知情同意书。

1.4 排除标准

不符合上述诊断及纳入标准者；合并其他甲型、丙型、丁型、戊型等急慢性肝炎、肝硬化、肝癌、肝衰竭等病史患者；合并其他器官及造血系统严重的原发或继发疾病和精神病患者；合并艾滋病、结核病等严重传染病者；妊娠期及哺乳期妇女。

2 方法

2.1 随机原则

本研究采用单盲法将纳入的80例患者按随机数字表法分为治疗组和对照组各40例，2组患者性别构成、年龄大小及病程长短等比较差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。

2.2 治疗方法

2组均给予一般西医综合治疗、对症处理及恩替卡韦分散片(正大天晴药业集团股份有限公司生产，国药准字H20100019)；治疗组在对照组基础上仅加用化肝纤方(由黄芪20 g、莪术15 g、丹参15 g、延胡索15 g、三七10 g、海藻10 g、昆布10 g、白芍15 g等组成)，由广西中医药大学第一附属医院煎药室代煎，每袋150 mL，每日2次，1次150 mL，早晚饭后温服，疗程为8周。

2.3 观察指标与检测方法

分别于治疗前、治疗第4周末、治疗后各采集患者清晨空腹静脉血，3500 r/10 min离心分离血清，置于-70 ℃低温冰箱中冻存待检。

2.3.1 2组血清CHI3L1水平 采用酶联免疫吸附试验(ELISA)测定，试剂盒购于浙江杭州普望生物技术有限公司，主要步骤：患者清晨空腹抽取静脉血3 ml，于真空干燥抗凝采血管中静置30 min后，3500 r/min离心机离心10 min，吸取上层血清。在96孔板中逐孔加入标准品和待测血清，并顺序加入抗体、亲和素与显色剂，于37 ℃恒温箱中充分孵育与反应，待反应完成后加入终止液，以酶标仪设置450 mm波长读取OD值，以标准品构建标准曲线，换算每孔待测样品中浓度值，严格按照说明书完成检测。

2.3.2 2组肝功能(ALT、AST、TBiL) 采集患者清晨空腹静脉血3 ml，离心取血清置于-70 ℃低温冰箱中待检；采用全自动生化分析仪(日立7600-020)测定ALT、AST、TBiL值，于治疗前、治疗第4周末、治疗后各检测1次。

2.3.3 2组肝纤4项 按上述方法收集患者血清，应用化学发光分析仪(迈瑞Mindray CL-2000i)，联合化学发光法及相关检测试剂，于治疗前、治疗第4周末、治疗后各检测1次透明质酸(HA)、Ⅳ型胶原(Ⅳ-C)、层黏蛋白(LN)、Ⅲ型前胶原(PC-Ⅲ)水平。

2.3.4 乙肝病毒DNA(HBV-DNA)转阴率 使用相关试剂及PCR荧光法(上海宏石SLAN-96P)测定治疗前、治疗第4周末、治疗后HBV-DNA水平；HBV-DNA≤102IU/mL为阴性。

2.3.5 肝脏硬度值(liver stiffness measurement，LSM) 患者于清晨空腹或进食后2 h，由操作次数≥500次的医师对患者进行FibroScan无创肝纤维化扫描(FibroScan502超声诊断仪：JX54700024)，于治疗前、治疗第4周末、治疗后各检测1次。

2.3.6 中医症状评分 以中医症状评分标准对2组患者自觉症状进行采集整理，参考《中药新药研究临床指导原则》[9]中病毒性肝炎常见症状分级量化表的相关证候及中医证候疗效判定标准，选择主要症状为神疲乏力、胁肋疼痛、食欲不振，次要症状包括口干而苦、恶心呕吐、大便异常(便溏或大便干结)的轻重分级量表。症状按照严重程度分为无、轻、中、重4个级别，主要症状分别记为“0”“2”“4”“6”分；次要症状记为“0”“1”“2”“3”分。

2.4 统计学方法

3 结果

3.1 治疗前后血清CHI3L1、肝纤4项水平变化比较

表1示，2组治疗前后血清CHI3L1水平、肝纤4项比较。治疗8周后，2组血清CHI3L1水平、肝纤4项均较治疗前明显下降(P<0.05)；治疗组患者治疗后血清CHI3L1及肝纤4项降低水平明显低于对照组(P<0.05)。

表1 2组治疗前后血清CHI3L1、肝纤4项比较

3.2 治疗前后肝功能(ALT、AST、TBiL)、HBV-DNA变化水平

表2示，2组治疗前后肝功能(ALT、AST、TBiL)、HBV-DNA水平比较。治疗8周后，2组肝功能(ALT、AST、TBiL)及HBV-DNA均较治疗前明显下降(P<0.05)；治疗组患者治疗后肝功能(ALT、AST、TBiL)降低水平明显低于对照组(P<0.05)；治疗组治疗后HBV-DNA与对照组对比，差异无统计学意义(P>0.05)。

表2 2组治疗前后ALT、AST、TBiL、HBV-DNA比较

3.3 治疗前后肝脏硬度值(LSM)、Fibrosis 4 Score(FIB-4指数)变化水平及FibroScan无创肝纤维化扫描图

表3图1示，2组治疗前后LSM值、FIB-4指数比较，治疗8周后，2组LSM值、FIB-4指数均较治疗前明显下降(P<0.05)，治疗组患者治疗后LSM值、FIB-4指数降低水平明显低于对照组(P<0.05)。

表3 2组治疗前后LSM值与FIB-4指数比较

注：图1a为治疗组患者治疗前运用Fibroscan超声扫描后，其肝脏硬度值(LSM)是8.7 kPa，四分位间距(Interquartile range，IQR)值为0.3，IQR/中值等于7%；图1b为治疗组患者治疗8周后，LSM值是6.2 kPa，IQR值为0.7，IQR/中值等于11%。与治疗前比较，患者肝脏硬度值下降2.5 kPa(IQR为10次检测结果的四分位间距，IQR/中值指四分位间距除以中位数值)

3.4 2组中医症状评分水平比较

表4示，2组治疗前后中医症状评分水平比较，治疗8周后2组中医症状评分较前明显降低(P<0.05)，治疗组治疗后中医症状评分明显低于对照组(P<0.05)。

4 讨论

慢性乙型病毒性肝炎仍是威胁人类生命健康安全的重要问题之一。据世界卫生组织报道，全球约20亿人曾感染HBV，其中有2.4亿为慢性HBV感染者[10]；我国是肝病大国，约有高达9300万人为慢性HBV感染者，若不能有效控制病毒，则会逐渐演变成慢性肝炎，慢性肝炎经久不治，将逐步往肝纤维化、肝硬化、肝癌甚至肝衰竭等预后较差的疾病发展，而肝纤维化是在各种慢性肝炎基础上向肝硬化转变的重要中间环节。由此，积极控制、治疗肝纤维化无疑成为延缓或截断疾病进展的良好渠道。

肝纤维化是慢性肝病发生发展的中间病理性过程。在慢性肝病向肝纤维化演变进程中，肝星状细胞(hepatic stellate cell，HSC)起着至关重要的作用。肝脏损伤因子诱导并激活肝星状细胞，其活化机制涵盖多种炎症因子及细胞通路，较为复杂，最经典的信号通路之一是TGFβ/Smad信号通路[11]，使肝星状细胞转变为肌成纤维细胞或成纤维细胞，从而导致肝细胞外基质(extracellular matrix，EMC)分泌增多，降解减少，促进慢性肝病向肝纤维化的转化[12]。因此可以推断，抑制静息状态的肝星状细胞及促进活化的肝星状细胞的凋亡，对肝纤维化的拮抗起到一定的促进作用，故肝纤维化的早发现、早诊断、早治疗，将为慢性肝病患者保驾护航，提高患者生活质量及生存率。

表4 2组治疗前后中医症状评分比较(分，

肝纤维化诊断及分期的“金标准”是肝脏组织活检，而这一有创的检查技术不能广泛地被患者接受，且可重复率低，在临床普遍应用受到多方面限制，不利于推广。由此，寻找新的可靠的无创肝纤维化血清学检测指标或将成为国内外学者研究的重点方向。近年来，CHI3L1作为最新发现的蛋白，是壳多糖家族中的一员，虽然含有几丁质结合结构域，但缺乏几丁质酶活性，在炎症及组织重塑中发挥着重要的关键性作用[13]。CHI3L1在肝脏中富集表达，且可在肝脏枯否细胞(kupffer cell，KC)中被诱导表达，从而激活肝星状细胞，可能直接参与肝纤维化的生成和维持。CHI3L1的特质及大量临床实验数据表明，血清CHI3L1检测可作为肝纤维化诊断及分期的重要临床参考指标。在血清CHI3L1的诊断基础上，联合肝纤4项及FIB-4评分已构建的肝纤维化诊断框架，可显著提高肝纤维化的诊断效能[14]，并将为肝纤维化患者提供又一简便、快捷、无创的检测方式，提高血清CHI3L1的临床应用价值。

目前尚未有抗肝纤维化的特效西药，而中西医结合治疗抗肝纤维化取得良好的治疗效果[15]。肝纤维化属于中医学“胁痛”“积聚”等范畴。《素问·脏气法时论篇》中说：“肝病者，两胁下痛引少腹，令人善怒。”《素问·举痛论篇》言：“寒气客于厥阴之脉，厥阴之脉者，络阴器，系于肝。寒气客于脉中，则血泣脉急，故胁肋与少腹相引痛矣。”《灵枢·五邪》云：“邪在肝，则两胁中痛，寒中，恶血在内。”《素问·刺热论篇》中有：“肝热病者，小便先黄……胁满痛，手足燥，不能安卧。”《金匮翼·积聚统论》[16]中云：“凡忧思欲怒，久不得解者，多成此疾。”《景岳全书·痢疾论》[16]有：“饮食之滞，留蓄于中，或结聚成块，或胀满硬痛，不化不行，有所阻隔者，乃为之积。”《杂病源流犀烛·积聚癥瘕痃癖痞源流》[16]说：“壮盛之人，必无积聚。必其人正气不足，邪气留着，而后患此。”由此可归纳出，肝纤维化的病因病机无外人体正气虚损，外邪、饮食、情志等因素内侵，导致气、血、痰等凝聚于肝而成此病，临床可见胁肋部疼痛、少腹疼痛、烦躁、不寐等表现。明·张介宾在《景岳全书·杂证谟》[16]中认为，积聚的治疗“然欲总其要不过四法，曰攻曰消曰散曰补，四者而已”，又有“肝体阴而用阳”的特点。广西中医药大学第一附属医院肝病中心在总结古籍、凝练肝纤维化病因病机的基础上，潜心研制化肝纤方，该方以豁痰化瘀、调整脏腑阴阳为主，用药忌刚宜柔，加用益气健脾、养阴柔肝之品而成。方中的黄芪[17]、丹参[18]、三七[19]、莪术[20]等中药经现代研究证实有减少肝内胶原沉积、改善肝脏微循环、促肝细胞再生和免疫调节等作用，可拮抗肝纤维化进程，改善肝纤维化患者临床症状，提高患者的生存质量。

基于血清CHI3L1及其他相关肝纤维化评判指标的研究结果显示，化肝纤方在抗肝纤维化方面具有良好的治疗效果，能有效延缓肝纤维化的进展，甚至在一定程度上可逆转肝纤维化，充分发挥了中医药在临床有效治疗慢性乙肝相关肝纤维化的作用，但研究者们仍然需要更进一步对化肝纤方抗肝纤维化的机制及分子层次进行研究探索，以更全面地评估化肝纤方的有效性及安全性，优化治疗方案，为临床广泛应用与推广中医药治疗肝纤维化奠定更完善的前期研究基础。