基于饱和中链脂肪酸的凝固-漂浮分散液液微萃取/高效液相色谱法测定水样中紫外屏蔽剂

胡西洲，洪 伟，张 仙，彭茂民，夏 虹，彭西甜*

(1.湖北省农业科学院农业质量标准与检测技术研究所/农产品营养品质与安全湖北省重点实验室，湖北 武汉 430064；2.长江大学 生命科学学院，湖北 荆州 434025)

二苯甲酮类化合物如4-羟基苯甲酮(HB)、2，4-二羟基苯甲酮(DB)、苯甲酮(BP)和2-羟基-4-甲氧基苯甲酮(HMB)是一类紫外屏蔽剂。该类物质已批准用于防晒产品配方中，还可用于塑料、涂料等工业产品的生产。然而，国际癌症研究机构数据表明，HMB在防止紫外线辐射时会引起动物模型的DNA损伤，同时在某些条件下也会引起光毒性，已被列为低优先使用等级[1]。由于该类物质在日常生活和工业生产中使用广泛，易对环境水样产生污染，给水生生物和人类健康带来严重威胁。因此，建立快速、高效、灵敏的环境水样中二苯甲酮类紫外屏蔽剂的分析方法具有重要意义。目前，该类物质的检测方法有液相色谱法[2-4]、气相色谱-质谱法[5-6]、液相色谱-质谱法[7-9]，其中质谱法成本高，而液相色谱法具有操作简单、成本低、易普及等特点。

近年来，样品制备技术正朝着高效、快速、环保、经济、微型化的方向发展。传统样品制备技术存在有机溶剂用量大、步骤繁琐、耗时费力等缺点，微萃取技术是顺应时代要求而发展起来的快速萃取技术，备受广大分析工作者的青睐[10]。2006年，Berijani等[11]提出了分散液液微萃取技术(Dispersive liquid-liquid microextraction,DLLME)。该技术在三相溶剂体系中，基于分散剂的作用(与萃取剂和水溶液均互溶)将不溶于水的微量萃取剂快速分散在溶液中，从而实现高效、快速萃取，现已广泛用于生物以及医药分析等领域。然而，传统的DLLME中萃取剂的用量少，回收较为困难。为提高微量萃取剂收集的便利性，凝固-漂浮分散液液微萃取(SFO-DLLME)应运而生，其主要利用萃取溶剂的凝固点较高且密度小于水的特点，经萃取后无需离心步骤，萃取剂在低温下迅速凝固，非常容易进行转移，常用的萃取剂有十二醇、十一醇、壬酸、辛酸等[12-14]。Shih等[15]以脂肪酸为萃取剂，通过调节溶液的pH值改变饱和中链脂肪酸的存在形式，高pH值时萃取剂以阴离子形式分散于溶液中完成萃取，低pH值时可利用中性脂肪酸具有强疏水性实现油水分离，从而对环境水样中的壬基酚和4-叔辛基酚进行快速萃取，整个萃取过程无需有机试剂。付博等[16]也利用该技术实现对酒类中4-乙基愈创木酚、4-乙基苯酚的快速萃取，整个过程非常快速、环保。

本研究以饱和中链脂肪酸(辛酸)为萃取剂，结合SFO-DLLME和高效液相色谱，建立了水样中上述4种紫外屏蔽剂的分析方法。在单因素条件优化的基础上，采用响应曲面优化法，获取最优的萃取效率。本方法简便快速，以辛酸为萃取剂，仅通过调节溶液pH值完成萃取过程，无需有机试剂和离心步骤，方法绿色环保，灵敏度和准确度高，具有良好的实用性。

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

辛酸(98%)、氨水(25%～28%)、浓硫酸(98%)(国药集团上海化学试剂有限公司)；甲醇、乙腈(色谱纯，Sigma-Aldrich上海公司)；4-羟基苯甲酮、2，4-二羟基苯甲酮、苯甲酮、2-羟基-4-甲氧基苯甲酮(99%，阿法埃莎(天津)化学有限公司)。实验用水由Millipore净水器(贝德福德，美国)制备。

E2695高效液相色谱仪，配 2998型二极管阵列检测器和自动进样器(美国Waters 公司)。

1.2 标准溶液的配制

分别称取上述4种紫外屏蔽剂标准物质各25 mg，用甲醇溶解并稀释定容至25 mL容量瓶中，制成1 000 mg/L的标准储备液。使用时以水稀释至所需质量浓度。所有溶液均保存于4 ℃冰箱中。

1.3 SFO-DLLME过程

取10 mL水样置于15 mL离心管中，加入3 g氯化钠和100 μL辛酸，涡旋形成乳浊液。随后向水样中加入100 μL氨水，涡旋萃取1 min，样品溶液立即变澄清。再加入1.2 mL浓硫酸，溶液恢复至乳浊液，振摇30 s后置于-20 ℃冰箱中，10 min后取出已固化的上层萃取剂，在室温下放置，待其融化后取出与等体积乙腈混合，进行HPLC分析。

1.4 色谱条件

色谱柱：Shim-pack VP-ODS柱(150 mm×4.6 mm×5 μm)；流动相：1%乙酸水溶液-乙腈(40∶60，体积比)，等度洗脱；流速为0.8 mL/min；进样体积为10 μL；柱温为40 ℃；检测波长为254 nm。

1.5 计算公式

富集倍数(PF)是指经萃取后4种紫外屏蔽剂的最终浓度与萃取前样品溶液中浓度的比值。计算公式如下：PF=Corg/Caq，其中Corg是指经校正曲线直接得到4种紫外屏蔽剂的浓度；Caq是指萃取前样品中4种紫外屏蔽剂的初始浓度。

萃取回收率(ER%)由以下公式得到：ER%=PF×Vorg×100/Vaq，其中Vorg和Vaq分别为萃取前后样品溶液的体积。

2 结果与讨论

2.1 SFO-DLLME条件的优化

SFO-DLLME的萃取溶剂需有合适的熔点和密度，满足凝固漂浮的要求，且便于萃取溶剂的回收。本研究对影响SFO-DLLME萃取效率的因素(萃取剂种类、萃取剂体积、氨水和浓硫酸的用量、离子强度及水样体积)分别进行考察，每组实验重复3次。

2.1.1 萃取剂种类的选择脂肪酸包含疏水性烷基和可电离的羧基，脂肪烷基的碳原子数决定了萃取剂的疏水性。当溶液的pH值高于其pKa时，脂肪酸电离成具有两亲性的脂肪酸盐；而当溶液的pH值低于其pKa时，化合物电离被抑制而增强其疏水性，导致油水相分离。因此，在高pH值时，脂肪酸相当于分散剂，与分析物形成油包水的胶束完成对分析物的萃取；而低pH值时，萃取剂的疏水性增强从而实现萃取。此外，熔点和密度对于萃取剂的回收非常重要。因此，本研究考察了凝固点较高且密度小于水的中链饱和脂肪酸壬酸(熔点9 ℃)和辛酸(熔点16 ℃)对4种紫外屏蔽剂的萃取性能，同时以常见的SFO-DLLME萃取试剂十二醇(熔点22～26 ℃)作为对照。

如图1A所示，辛酸的萃取性能高于十二醇，而壬酸的萃取性能与十二醇相当。此外，十二醇不受溶液pH值的影响，在溶液中不易分散，需要数十倍的涡旋(萃取)时间才获得较好的萃取效果。因此，选择辛酸作为萃取剂。

2.1.2 萃取剂体积的选择吸取10 mL水溶液置于15 mL离心管中，分别加入60、80、100、120、140 μL的辛酸，考察了萃取剂体积对萃取性能的影响。如图1B所示，萃取效率随着萃取剂体积的增加先增加而后逐渐减小，当萃取剂体积为100 μL时，萃取效率达到最高。这可能是由于随着萃取剂体积的增加，分析物与萃取剂接触的量增多，增加了分析物的萃取效率，而过多的萃取剂会导致稀释效应。所以选择萃取剂体积为100 μL。

2.1.3 氨水及浓硫酸体积的选择由于样品溶液的pH值会影响脂肪酸在溶液中的存在形态，通过加入氨水促使脂肪酸离子化。考察了氨水体积(70、90、110、130、150 μL)对萃取性能的影响，结果显示当氨水体积为90 μL时，萃取效率达到最大；继续增加氨水用量则会造成萃取效率降低。一方面，过高的pH会使部分分析物发生电离导致萃取效率降低；另一方面可能是因为加入过量的氨水，需要更多的酸来中和，而后续操作中浓硫酸的体积保持不变，会造成部分辛酸仍以离子形式保留于水溶液中而不利于萃取。所以选择氨水体积为90 μL。

辛酸的pKa值为4.9，为将阴离子形式转变为其分子状态，所加酸的量至少要将溶液的pH值降低至比辛酸的pKa值小3[15-16]。相比于盐酸和硝酸，浓硫酸属于不挥发性二元酸，对环境污染小且用量小，所以选择浓硫酸为反应试剂。考察了不同体积(0.4 ～1.4 mL)浓硫酸对萃取效率的影响，结果表明当浓硫酸的体积为1.2 mL时，4种紫外屏蔽剂的萃取效率达到最高，继续增加浓硫酸用量，回收率略有下降。可能是由于随着浓硫酸用量的增加，辛酸逐渐恢复至中性状态，可收集萃取剂体积的增加引起稀释效应所致。因此，选择浓硫酸体积为1.2 mL。

2.1.4 离子强度的影响在样品萃取过程中，通常在溶液中加入无机盐以增加离子强度，降低分析物在样品溶液中的溶解度，提高萃取效率。考察了氯化钠加入量(0～4 g)对萃取效率的影响。如图1C所示，4种紫外屏蔽剂的萃取效率随着盐浓度的增加而增大，当氯化钠加入量为3 g时萃取效率达到最高，而氯化钠加入量大于3 g时会导致萃取效率降低。原因可能是盐析效应可促进萃取效率的提高，而过高的盐浓度导致溶液粘度变大，阻碍分析物的传质。因此，萃取前在溶液中添加3 g氯化钠。

2.1.5 样品溶液体积的选择在一定范围内，增加样品溶液的体积可以提高富集倍数。分别取7、9、10、11、13 mL添加混合标准溶液的水样，置于15 mL离心管中，考察了样品溶液体积对萃取性能的影响。结果如图1D所示，萃取量随样品溶液体积的增加而增加，萃取回收率反而降低。综合考虑，选择样品溶液体积为10 mL。

2.2 响应曲面实验结果分析

表1 Box-Behnken实验设计和响应结果Table 1 Experimental design and response result of Box-Behnken

2.2.1 回归模型的建立与分析在上述单因素实验的基础上，选择萃取剂体积(60、100、140 μL)、氨水体积(60、90、120 μL)、浓硫酸体积(1.0、1.2、1.4 mL)3个对峰面积有显著影响的因素，设计了3因素3水平的响应曲面分析实验，以获得最佳萃取效率。Box-Behnken实验设计和响应结果见表1。

通过Minitab 17(Pennsylvania,USA)软件对表1的响应曲面实验结果进行分析，得到实验条件与响应值间的回归模型：

Y=4.63×105+2.46×104X1+6.96×104X2+2.32×104X3-5.5×104X1X1-5.25×104X2X2-6.88×104X3X3-5.5×103X1X2-1.125×104X1X3-8.25×103X2X3

式中：Y为待测物的总峰面积；X1为萃取剂体积(μL)；X2为氨水体积(μL)；X3为浓硫酸体积(mL)。

对回归模型进行方差分析(见表2)，得到的回归模型极显著(P<0.01)，失拟项不显著(P=0.289>0.05)，说明所建模型可靠。相关系数(R2)为0.981 2，说明该模型拟合程度较好，预测值与实测值之间有较好的相关性。

由表2方差分析结果可知，X2极显著(P<0.01)，X1、X3均显著(P<0.05)，X1X2、X1X3、X2X3均不显著(P>0.05)，X1X1、X2X2、X3X3均极显著(P<0.01)。表明各因素与响应值之间不是简单的线性关系。

表2 方差分析结果Table 2 Result of variance analysis

**：extremely significant(P<0.01);*：significant(P<0.05);-：not obvious(P>0.05)

2.2.2 响应曲面交互作用分析根据上述回归方程绘制响应曲面图(图略)，结果显示总峰面积随3个因素的变化均为开口向下的抛物线，即4种紫外屏蔽剂的总峰面积最初随3个因素的增大而逐渐升高，在超过各因素的中心值后，4种紫外屏蔽剂的总峰面积随各因素的增大而下降。

2.2.3 最佳工艺条件的确定以及验证实验由响应曲面图获得最佳提取条件：萃取剂体积为102.28 μL，氨水体积为98.76 μL，浓硫酸体积为1.21 mL，此条件下4种紫外屏蔽剂的总峰面积为489 618。考虑到操作便利性和萃取效率，确定萃取剂体积为100 μL，氨水体积为100 μL，浓硫酸体积为1.2 mL。在该条件下得到的总峰面积约为478 787，与理论值接近，说明本研究优化得到的萃取条件可靠。

2.3 方法学评价

配制质量浓度分别为0.01、0.05、0.2、0.5、2.0、5.0、10.0 mg/L的系列混合标准溶液，在优化条件下进行测定，以4种紫外屏蔽剂的峰面积(y)对其质量浓度(x，mg/L)进行线性拟合。结果表明，4种紫外屏蔽剂在0.01～10.0 mg/L范围内呈良好的线性关系，相关系数(r)为0.994 6～0.999 6。HB、DB、BP和HMB的方法检出限(S/N=3)分别为0.18、0.37、0.46、0.76 μg/L，富集倍数分别为42、49、46和47倍。

配制0.1 mg/L的4种分析物混合标准溶液，同日内测定6次，连续测定3 d，以日内和日间相对标准偏差(RSD)评估方法精密度；在空白水样中加入0.05、0.5、5 mg/L混合标准溶液进行回收率实验，每组设置3个平行。如表3所示，日内与日间RSD为1.9%～9.6%，加标回收率为73.8%～103%，表明方法具有很好的准确度和精密度。

表3 4种紫外屏蔽剂的回收率与相对标准偏差Table 3 Recoveries and relative standard deviations of four ultraviolet filters

2.4 方法比较

将本方法与文献方法进行了比较，结果如表4所示。本方法检出限低于文献[8]，与其他方法相当。该法与纤维相吸附萃取法(FPSE)[3]、固相微萃取法(SPME)[5]相比操作简便、快捷；与以离子液体[2]作为萃取剂的方法相比，本文所用萃取剂的价格低且绿色环保；样品制备过程中有机溶剂用量极少(100 μL)，且省去离心步骤，具有良好的操作性和实用性。

表4 与其他萃取方法的比较Table 4 Comparison with other extraction procedures

图2 实际废水样品的色谱图Fig.2 Chromatograms of ultraviolet filters in waste water sample a,b and c represent waste water sample before extraction,after extraction and spiked samples after extraction,respectively

2.5 实际样品分析

为进一步验证方法的适用性，在武汉周边地区采集3种水样，包括生活废水、涂料厂废水与湖水，采用本方法进行分析。结果显示，在涂料厂废水中检出DB和HMB的质量浓度分别为0.82、0.36 mg/L，另两种样品中均未检出4种分析物。在3种水样中添加0.1 mg/L的紫外屏蔽剂混合标准溶液，结果表明，4种紫外屏蔽剂的回收率为76.8%～102%，RSD为3.8%～8.7%，表明该方法适用于水样中4种紫外屏蔽剂的定量分析。涂料厂废水萃取前、后及加标的色谱图见图2。

3 结 论

本研究建立了一种基于饱和中链脂肪酸的凝固-漂浮分散液液微萃取方法，并用于水样中4种紫外屏蔽剂的高效液相色谱测定。通过调整溶液的pH值改变脂肪酸的存在形式，进而实现高效、快速萃取。整个萃取过程只需使用氨水和浓硫酸，符合绿色化学发展的要求；萃取时间短，无需离心。该方法线性关系良好，具有良好的精密度和准确度，可作为水样中有机物萃取制备传统技术的重要补充方法。