胡椒碱-茶氨酸共无定型复合物的制备与体内外研究

黄丽华，沈花，韩怡

(南京中医药大学附属张家港医院，江苏 张家港 215600)

胡椒碱(Piperine，PIP)是胡椒科植物胡椒PipernigrumL.和荜菝PiperlongumL.中一种生物碱[1-2]，药理作用广泛，例如抗氧化、抗抑郁、抗癌等[3-7]。但PIP属于水难溶性药物，在25 ℃下的溶解度仅为22.34 μg/mL[8-9]，导致其极低的口服吸收。

多种技术被用来改善药物的溶解度/溶出度及口服吸收利用度，如环糊精包合物[10]、脂质体[11]、无定型固体分散体[12]、纳米制剂[13-15]等。其中，通过打破晶格结构的无定型化技术是改善药物生物利用度的最有效策略之一。但是，处于高能态的无定型容易向稳定的晶体形式转变，造成其潜在较差的物理稳定性。目前改善无定型稳定性的技术主要是将药物和高分子聚合物制备成无定型固体分散体(Amorphous solid dispersion，ASD)[16]。但是，由于ASD往往载体用量大，导致服药量大；大量聚合物吸湿性强，易造成药物稳定性差而发生转晶现象[17-18]。此外，还存在药物与聚合物混溶性差、胃肠道毒性等问题。

共无定型复合物(Co-amorphous complex，CAC)由药物和小分子物质(如氨基酸、有机酸等)组成，可以有效解决ASD的应用缺陷问题，已经引起广泛的注意。CAC是药物和小分子物质组成的二元无定型系统[19-21]。其中，小分子物质主要为氨基酸、有机酸或其他小分子药物等。与ASD不同，CAC具有较低的口服剂量及较高的物理稳定性[22-24]。而且，CAC能形成过饱和溶出，在溶出液中，药物的浓度大于药物的平衡溶解度，使得更多药物能被人体吸收，因此能有效提高胃肠道的药物吸收量[25-26]。

茶氨酸(Theanine，THE)水溶性良好，常作为共无定型复合物的配体，具有降血压、增强免疫力、镇静等作用。据此，实验将PIP与THE共同制备成CAC(PIP-THE CAC)，采用差示扫描量热分析(DSC)、粉末X-射线衍射(XRPD)、傅里叶红外光谱(FTIR)和扫描电镜(SEM)进行表征分析，并考察制剂的体外溶出、稳定性及生物利用度。

1 材料

1.1 仪器

LC-2010A HT高效液相色谱仪(日本Shimadzu公司)；Bromanil C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；D8 Advance X-射线粉末衍射仪(德国Bruker公司)；Q2000差示扫描量热仪(美国TA公司)；IRTracer-100红外光谱仪(日本Shimadzu公司)；SNE-4500扫描电镜(日本Hitachi公司)；HY68/RCY-1智能溶出试验仪(北京中西远大科技有限公司)；药物综合稳定试验箱(德国Elliot有限公司)；离心浓缩仪(美国Labconco公司)。

1.2 药品与试药

PIP(批号：BD16710，纯度:97%)、THE(批号：BD33297，纯度:97%)均购于上海毕得医药有限公司；PIP对照品(批号：110775-201405，纯度:98.9%)购于中国食品药品检定研究院；维拉帕米(VER)(批号：V111249，纯度:99%)、吐温-80购于上海阿拉丁有限公司；乙腈(色谱纯)购于美国Tedia公司；氢氧化钠、盐酸、磷酸二氢钾购于国药集团有限公司；水为超纯水。

1.3 动物

SPF级SD大鼠，体质量约(220±20)g，雄性，购自上海杰思捷实验动物繁殖场，动物生产许可证号:SCXK(沪)2013-0006。

2 方法与结果

2.1 PIP-THE CAC分析方法的建立

2.1.1 色谱条件 采用Bromanil C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流动相：乙腈-0.5%磷酸水溶液(体积比60∶40)；柱温:35 ℃；流速：1 mL/min；检测波长：342 nm；进样量：10 μL。

2.1.2 线性关系考察 取25 mL棕色容量瓶，精密称取5.282 mg PIP对照品，置于容量瓶中，用甲醇溶解，超声并定容到所示刻度，配制成浓度为211.28 μg/mL的PIP对照品储备液。将PIP对照品溶液逐级稀释，按“2.1.1”项下色谱条件测定。横坐标为PIP对照品浓度(X，μg/mL)，纵坐标(Y)为PIP的峰面积，绘制标准曲线。

2.1.3 精密度考察 分别取浓度为6.60、52.85、150.64 μg/mL的低、中、高浓度的PIP对照品溶液，通过“2.1.1”项下色谱条件进样6次，结果PIP峰面积RSD(n=6)分别为2.01%、1.96%、2.45%。

2.1.4 稳定性考察 取100 mL棕色容量瓶，准确称取适量的PIP-THE CAC制剂，置于容量瓶中，用甲醇溶解，超声并定容到所示刻度，得到的PIP的浓度为55.50 μg/mL，通过“2.1.1”项下色谱条件，分别在0、2、4、8、12、24 h时间点进样，测得PIP峰面积的RSD(n=6)为2.85%。

2.1.5 重复性考察 平行制备PIP-THE CAC的供试品溶液6份，按“2.1.1”项下色谱条件，进样分析，计算PIP的平均质量分数为96.01%，RSD(n=6)为2.65%。

2.1.6 加样回收率考察 称取6份已知含量的PIP-THE CAC制剂适量，分别加入等量的PIP对照品，按照“2.1.4”项下方法制备加样回收的供试品溶液，按“2.1.1”项下色谱条件进样分析。结果PIP-THE CAC中PIP的平均加样回收率为97.12%，RSD(n=6)为2.03%。

2.2 PIP-THE CAC的制备

采用淬火冷却法制备PIP-THE CAC。取PIP和THE总质量为2 000 mg(摩尔比为1∶1，其中PIP为1 241.8 mg、THE为758.2 mg)，混合均匀，置于150 ℃恒温电热板上，完全熔融5 min后，立即置于液氮冷却，放入真空干燥箱24 h，用研钵研成细粉，过60目筛，保存在含有无水氯化钙和变色硅胶的干燥器中。

由于通过淬火冷却法无法制备无定型PIP，因此采用原位DSC法制备无定型PIP，并测定其玻璃化转变温度(Tg)。

2.3 PIP-THE物理混合物的制备

取2 000 mg的PIP和THE原料药混合物(摩尔比为1∶1，其中PIP为1 241.8 mg、THE为758.2 mg)，放入100 mL烧杯中，置涡旋仪上震荡30 min，使两者充分均匀混合，即得PIP-THE物理混合物(PIP-THE physical mixture，PIP-THE PM)。

2.4 PIP-THE CAC的表征分析

2.4.1 DSC 分别取PIP及THE原料药、PIP-THE PM、PIP-THE CAC适量(约4～8 mg)置于铝坩埚中，在Q2000差示扫描量热仪进行分析，测试条件如下：升温速率为10 ℃/min；氮气流速为40 mL/min；升温范围为10～240 ℃。为了测定无定型PIP的Tg，取PIP原料药适量(4～8 mg)置于铝坩埚，在差示扫描量热仪中加热到150 ℃，完全熔化，快速降温至-50 ℃，再以10 ℃/min升温。测试结果见图1。

图1 PIP原料药(a)、THE原料药(b)、无定型PIP(c)、PIP-THE PM(d)、PIP-THE CAC(e)的DSC图

由图1可知，晶体PIP的熔点峰在129.8 ℃处；晶体THE的熔点峰在203.5 ℃处；通过DSC法测定的无定型PIP的Tg值为13.7 ℃，该Tg值较低，常温下为过冷液态，且无定型PIP极不稳定，容易发生晶型转变；PIP-THE PM在129.8 ℃和203.5 ℃处存在晶体吸热峰，分别为PIP原料药和THE原料药的熔点峰；而在PIP-THE CAC中，PIP原料药和THE原料药的晶体熔点消失，且存在单一的Tg值(51.3 ℃)，证实通过淬火冷却法成功制备PIP-THE CAC。

2.4.2 XRPD 分别取PIP及THE原料药、PIP-THE PM、PIP-THE CAC适量，铺平于载玻片上，置于D8 Advance X-射线粉末衍射仪进行分析。测定条件如下：扫描范围为3°～40°(2θ)；扫描速度2°/min；步长为0.02°；Cu靶(40 kV，40 mA)。测试结果见图2。

图2 PIP原料药(a)、THE原料药(b)、PIP-THE PM(c)、PIP-THE CAC(d)的XRPD图谱

由图2可知，PIP原料药在12.8°，14.2°，14.7°，16.0°，16.8°，19.6°，21.6°，22.3°，24.1°，25.8°，28.2°处有较强的晶体特征衍射峰；THE原料药在4.5°，13.4°，18.1°，19.7°，22.7°，27.3°，31.8°，36.8°处有较强的晶体特征衍射峰；PIP-THE PM中存在PIP原料药和THE原料药的晶体特征衍射峰；而PIP-THE CAC呈无定型独特的特征衍射环，也就是PIP原料药和THE原料药的晶体特征衍射峰完全消失，证实PIP-THE CAC为无定型形式。

2.4.3 FTIR 分别取PIP及THE原料药、PIP-THE PM、PIP-THE CAC适量，置于IRTracer-100红外光谱仪中分析。测试条件如下：扫描范围4 000～600 cm-1；分辨率为2 cm-1。测试结果见图3。

图3 PIP原料药(a)、THE原料药(b)、PIP-THE PM(c)、PIP-THE CAC(d)的FTIR图谱

由图3可知，PIP原料药在3 008 cm-1及2 942 cm-1处存在苯环和亚甲二氧基上C-H的伸缩振动吸收峰，在1 632 cm-1处存在C=O的伸缩振动吸收峰；对于THE原料药来说，在3 327 cm-1处，-NH发生伸缩振动，且在1 645 cm-1处，C=O发生伸缩振动；就PIP-THE PM而言，PIP原料药和THE原料药的特征振动吸收峰依旧存在，表明在PIP-THE PM中，PIP原料药和THE原料药之间没有发生相互作用；而在PIP-THE CAC中，PIP原料药在3 008 cm-1及2 942 cm-1处C-H的特征吸收峰明显减弱，在1 632 cm-1处存在的C=O伸缩振动峰已经消失，THE原料药在3 327 cm-1处的-NH伸缩振动峰同时消失，表明PIP原料药与THE原料药之间可能发生了分子间氢键的相互作用。

2.4.4 SEM 分别取PIP及THE原料药、PIP-THE PM、PIP-THE CAC适量，均匀撒于贴有导电胶带样品座上，喷金5 min，用干净镊子取出，置于SNE-4500扫描电镜仪内，采用3 kV的加速电压扫描其表面，并进行拍照。测试结果见图4。

图4 PIP原料药(A)、THE原料药(B)、PIP-THE PM(C)、PIP-THE CAC(D)的SEM图

由图4可知，SEM用来观察PIP原料药、THE原料药、PIP-THE PM、PIP-THE CAC的表面形貌，PIP原料药多呈大小不一的椭球状，表面相对光滑；THE呈相对规则的柱状；在PIP-THE PM中，存在PIP原料药的椭球状特征及THE原料药的柱状特征；而在PIP-THE CAC中，呈不规则块状、颗粒状，PIP原料药的椭球状特征及THE原料药的柱状特征已完全消失。

2.5 漏槽条件下PIP-THE CAC的体外溶出

为了考察不同样品的累积溶出率，精密称取PIP原料药(10 mg)、PIP-THE PM(16.11 mg，PIP与THE摩尔比1∶1，其中PIP为10 mg)、PIP-THE CAC制剂(16.11 mg，其中PIP为10 mg)，按2015年版《中国药典》四部附录XC溶出度测定法(浆法)进行体外溶出实验(n=3)，考察不同样品的累积溶出率。溶出介质分别为0.5%吐温-80的pH 1.2盐酸缓冲溶液、0.5%吐温-80的pH 6.8磷酸盐缓冲液，转速为100 r/min，溶出介质体积为900 mL，温度为37 ℃，分别于设定的时间点(5、15、30、45、60、90、120 min)取样5 mL，立刻补足等温等量的介质，溶出液用0.45 μm微孔滤膜进行过滤，按“2.1.1”条件进行分析，计算出各时间点的PIP累计溶出率。漏槽条件下溶出结果见图5。

注：A.0.5%吐温-80的pH 1.2盐酸缓冲溶液;B.0.5%吐温-80的pH 6.8磷酸盐缓冲液;与PIP原料药比较，*P<0.05，**P<0.01。图5 PIP原料药、PIP-THE PM和PIP-THE CAC在漏槽条件下的溶出曲线

由图5可知，在漏槽条件下，在0.5%吐温-80的pH 1.2盐酸缓冲溶液、0.5%吐温-80的pH 6.8磷酸盐缓冲液2种溶出介质中，与PIP原料药相比，PIP-THE PM中PIP的累计溶出率稍有提高，但无明显差异；而PIP-THE CAC的累计溶出率显著提高(P<0.01)。在0.5%吐温-80的pH 1.2盐酸缓冲溶液中，30 min时，与PIP原料药(20.12%)比较，PIP-THE CAC制剂的累计溶出率(83.92%)显著提高(P<0.01)；120 min时，与PIP原料药(33.12%)比较，PIP-THE CAC制剂的累计溶出率(90.70%)显著提高(P<0.01)。此外，在0.5%吐温-80的pH 6.8磷酸盐缓冲液中，30 min时，与PIP原料药(24.46%)比较，PIP-THE CAC制剂的累计溶出率(85.26%)显著提高(P<0.01)；120 min时，与PIP原料药(37.46%)比较，PIP-THE CAC制剂的累计溶出率(89.37%)显著提高(P<0.01)。漏槽条件下体外溶出实验结果表明，制备的PIP-THE CAC能显著提高PIP的溶出速率。

2.6 非漏槽条件下PIP-THE CAC的体外溶出

为了考察PIP-THE CAC的超饱和行为，精密称取PIP原料药(100 mg)、PIP-THE PM(161.1 mg，PIP与THE摩尔比1∶1，其中PIP为100 mg)、PIP-THE CAC制剂(161.1 mg，其中PIP为100 mg)，按2015年版《中国药典》四部附录XC溶出度测定法(浆法)进行体外溶出实验(n=3)，溶出介质分别为0.5%吐温-80的pH 1.2盐酸缓冲溶液、0.5%吐温-80的pH 6.8磷酸盐缓冲液，转速为100 r/min，溶出介质体积为200 mL，温度为37 ℃，分别于设定的时间点(5、10、15、20、30、45 min，1、1.5、2、4、6、8、12、24 h)取样2 mL，立刻补足等温等量的介质，溶出液用0.45 μm微孔滤膜进行过滤，滤液用同等体积甲醇进行稀释，按“2.1.1”项下条件进行分析，计算出各时间点的PIP浓度。非漏槽条件下溶出结果见图6。

注：A.0.5%吐温-80的pH 1.2盐酸缓冲溶液;B.0.5%吐温-80的pH 6.8磷酸盐缓冲液；与PIP原料药组比较，*P<0.05，**P<0.01。图6 PIP原料药、PIP-THE PM和PIP-THE CAC在非漏槽条件下的溶出曲线

由图6可知，在非漏槽条件下，在2种溶出介质中，PIP原料药与PIP-THE PM的溶出趋势相似。在0.5%吐温-80的pH 1.2盐酸缓冲溶液、0.5%吐温-80的pH 6.8磷酸盐缓冲液2种溶出介质中，PIP原料药与PIP-THE PM的溶出曲线相似，呈现较低浓度的溶出行为。在1 h后，PIP原料药与PIP-THE PM中PIP的浓度维持在70～80 μg/mL之间，处于饱和平衡状态。而PIP-THE CAC在2种溶出介质中，处于高浓度的超饱和状态，PIP-THE CAC在0.5%吐温-80的pH 1.2盐酸缓冲溶液和0.5%吐温-80的pH 6.8磷酸盐缓冲液中的最大溶出浓度分别为346.03 μg/mL和366.49 μg/mL，分别是PIP原料药的4.75倍和5.03倍(P<0.01)。相比于PIP原料药和PIP-THE PM，PIP-THE CAC中PIP具有较高的体外溶出表现，并且维持长时间的超饱和状态。在24 h时，PIP-THE CAC中PIP的溶度仍远远高于PIP原料药与PIP-THE PM。

2.7 物理稳定性试验

将PIP-THE CAC以及DSC法制备的无定型PIP置于药品综合稳定试验箱，在40 ℃，75%相对湿度下进行物理稳定性试验。通过XRPD分析，判断PIP-THE CAC、无定型PIP是否发生重结晶，评价PIP-THE CAC的物理稳定性，稳定性结果见图7。

图7 在40 ℃ 75%相对湿度下的1 d无定型PIP(a)、PIP-THE CAC(b)，15 d PIP-THE CAC(c)，30 d PIP-THE CAC(d)的XRPD图

由图7可知，通过原位DSC法制备的无定型PIP在40 ℃/75%相对湿度下放置1 d，出现PIP原料药晶体特征衍射峰，表明无定型PIP极不稳定，药物发生了由无定型向晶型的转变，该结果与DSC测定结果相一致。而PIP-THE CAC在40 ℃，75%相对湿度下放置15、30 d，均未出现晶体特征衍射峰，表明在PIP-THE CAC中，并未发生晶型转变，物理稳定性良好。由于PIP-THE CAC系统中，PIP和THE发生分子间氢键的相互作用，减小了晶体和无定型固体之间的自由能，导致物理稳定性的提高。

2.8 PIP-THE CAC药代动力学研究

2.8.1 分组与给药 取雄性SD大鼠，随机分为PIP原料药组、PIP-THE PM组和PIP-THE CAC组，灌胃给药80 mg/kg[26]，每组6只，共18只。给药前12 h禁食，但不禁水。每组药物用0.2%的CMC-Na进行混悬，于给药后不同时间点(10、20、30 min，1、2、3、4、6、8、12、24 h)，大鼠眼眶取血(0.3 mL)于2 mL肝素化离心管，以6 000 r/min于离心机中离心5 min，取上清血浆，于-80 ℃冷冻保存，等待进一步分析。

2.8.2 血浆样品的处理 吸取100 μL血浆样品于2 mL离心管，分别加入10 μL的VER内标溶液(6.33 μg/mL甲醇溶液)和10 μL的甲醇，涡旋2 min。加入1 mL乙酸乙酯，涡旋2 min，10 000 r/min离心5 min。吸取上清液900 μL转移至新离心管中，离心浓缩处理，挥干溶剂。然后加入初始流动相200 μL进行复溶，涡旋5 min，10 000 r/min离心5 min，吸取上清液，通过高效液相色谱进行分析。

2.8.3 色谱条件 采用Bromanil C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流动相：乙腈-0.5%磷酸水溶液(体积比为60∶40)；柱温：35 ℃；流速：1 mL/min；检测波长：342 nm(PIP)，207 nm(VER，内标)[26-27]；进样量：10 μL。

2.8.4 线性关系考察 吸取100 μL空白血浆，分别加入一系列PIP的对照品溶液10 μL，配制模拟的血浆样品。除不加入10 μL甲醇外，分别按“2.8.2”“2.8.3”项下方法进行血浆样品处理和色谱分析，记录峰面积。以PIP浓度(X，μg/mL)为横坐标，PIP与VER内标的峰面积比(Y)为纵坐标。得到回归方程为Y=0.006X-0.04，R2=0.998，PIP在0.42～52.82 μg/mL内线性关系良好。

2.8.5 精密度试验 吸取100 μL空白血浆，分别制备质量浓度为3.30、13.21、26.41 μg/mL的低、中、高PIP血浆样品6份，分别按“2.8.2”“2.8.3”项下方法进行血浆样品处理和色谱分析。对每个浓度的样品，分别同日内连续测定3次或连续测定6 d(每天测定1次)，评估日内精密度和日间精密度。结果显示，PIP的日内精密度RSD分别为4.13%、3.25%、4.88%(n=3)，日间精密度RSD分别为5.50%、6.22%、4.17%(n=6)。

2.8.6 准确度试验 吸取100 μL空白血浆，分别制备质量浓度为3.30、13.21、26.41 μg/mL的低、中、高PIP的质控样品，分别按“2.8.2”“2.8.3”项下方法进行血浆样品处理和色谱分析，记录色谱图。以PIP的峰面积计算的相应质量浓度与真实质量浓度的比值计算回收率。结果，低、中、高质量浓度的PIP样品回收率分别为92.53%、94.41%、96.36%，RSD分别为4.22%、3.22%、4.14%(n=6)。

2.8.7 稳定性试验 吸取100 μL空白血浆，分别制备质量浓度为3.30、13.21、26.41 μg/mL的低、中、高PIP的质控样品，每个浓度6份，分别置于以下条件保存：室温放置12 h；置于-20 ℃，冻存14 d后解冻；-20 ℃至室温反复冻融3次。上述样品除不加甲醇外，分别按“2.8.2”“2.8.3”项下方法进行血浆样品处理和色谱分析。结果显示，室温放置12 h后PIP峰面积的RSD为3.17%，置于-20 ℃冻存14 d后PIP峰面积的RSD为2.85%，-20 ℃至室温反复冻融3次后PIP峰面积的RSD为3.94%(n=6)。

2.8.8 重复性试验 吸取100 μL空白血浆，加入质量浓度为13.21 μg/mL的PIP对照品溶液，分别按“2.8.2”项下的血浆样品的处理方法平行制备6份，“2.8.3”项下色谱条件进行分析，记录色谱图。结果显示，PIP的峰面积RSD为2.91%(n=6)，表明处理方法的重复性良好。

2.8.9 基质效应 吸取100 μL空白血浆，分别制备质量浓度为3.30、13.21、26.41 μg/mL的低、中、高PIP的质控样品，除不加入甲醇外，分别按“2.8.2”“2.8.3”项下方法进行血浆样品处理和色谱分析。计算PIP峰面积与内标峰面积的比值A1；同时向100 μL流动相中加入PIP对照品及VER内标溶液各10 μL混合后分析，得PIP峰面积与内标峰面积的比值A2。样品的基质效应为A1/A2×100%。结果，PIP的基质效应为94.55%、93.28%、96.11%(n=6)。

图8 大鼠体内PIP血药浓度-时间曲线图

表1 PIP原料药组、PIP-THE PM组和PIP-THE CAC组中PIP的药代动力学参数

由PIP血药浓度-时间曲线图和药代动力学参数表可知，大鼠灌胃给药后，PIP原料药组与PIP-THE PM组之间无显著性差异。PIP-THE CAC组的AUC0-24 h显著提高(P<0.01)，是PIP原料药组的1.93倍，同时PIP-THE CAC组的Cmax也显著提高(P<0.01)，是PIP原料药组的2.03倍。PIP-THE CAC组tmax减少至PIP原料药组的61%。

3 讨论

通过特定技术，将低水溶性药物由晶型转变成无定型，可以有效增强药物的溶解度/溶出度[28]。众所周知，无定型态属于高能态，为热力学不稳定体系，容易发生无定型向晶型的转变，结果会造成潜在的溶解度优势的消失。近些年来，CAC已经引起人们广泛的兴趣，与ASD相比具有多种优势，包括无明显吸湿性，物理稳定性高，载药量和混溶性良好。

在本实验中，通过DSC、XPRD对制备的PIP-THE CAC进行表征分析，证实成功制备PIP-THE CAC。FTIR结果表明在PIP-THE CAC中PIP与THE发生分子间氢键的相互作用，氢键相互作用能有效抑制晶型转变来提高共无定型系统的稳定性，导致PIP-THE CAC物理稳定性的提高。SEM结果显示，PIP-THE CAC呈不规则块状、颗粒状，已不见PIP原料药与THE原料药的特征。通过体外溶出实验(漏槽和非漏槽条件下)，与PIP原料药及PIP-THE PM相比，PIP-THE CAC有更好的溶出表现并且维持长时间超饱和状态。究其原因，PIP-THE CAC为无定型态，缺少晶格的束缚，具有高的吉布斯自由能，因而导致PIP良好的溶出表现，且在PIP-THE CAC中，PIP和THE之间的相互作用，抑制了无定形药物的成核和晶体生长，因此可以有效维持长时间超饱和状态。另外，CAC具有过饱和溶出表现，药物的浓度大于药物的平衡溶解度，使得更多药物能被人体吸收，且过饱和维持的时间越长，吸收到体内的药物量越高[27,29]。因此，将PIP和THE联合使用制备的PIP-THE CAC能有效提高PIP的溶解度、溶出度以及生物利用度。