黄芪甲苷通过NLPR3炎性小体调节糖尿病动脉粥样硬化早期大鼠血脂及炎症因子的研究

葛凡，王文恺，朱景天，李子航，孙悦，薛梅

(南京中医药大学中医学院·中西医结合学院，江苏 南京 210023)

糖尿病动脉粥样硬化是由于机体胰岛素分泌不足或胰岛素抵抗引起的糖脂代谢紊乱和炎性因子大量释放，最终导致泡沫细胞的出现，动脉粥样硬化形成[1]，是糖尿病患者死亡的主要原因。动脉粥样硬化是多步骤过程的结果，脂质代谢的改变是其危险因素和特征。研究发现，葡萄糖水平升高、血脂异常以及伴随疾病发展的其他代谢改变几乎存在于动脉粥样硬化的全过程。胆固醇是众所周知的引起冠状动脉病变的危险因素，有研究表明[2]，高脂肪/高胆固醇饮食会加重动脉炎症和氧化应激，并损害内皮功能。GK大鼠被喂食高脂饲料后，被证实发生类似于糖尿病患者早期动脉粥样硬化的病变，其特征是血管壁脂质过度积聚[3-4]。此外，慢性炎症被认为是动脉粥样硬化发展的关键因素之一[5]，也被认为是动脉粥样硬化和糖尿病之间的可能联系之一。NLRP3炎性小体是目前最具特征的炎性小体[6-7]，由NOD样受体NLRP3，衔接子ASC和Caspase-1组成，抑制其表达，能有效减少斑块的形成，促进斑块的稳定性并改善血管功能[8]。

黄芪甲苷是黄芪的提取物，可通过减弱氧化应激反应，减少炎症，调节代谢异常，从而改善脂质蓄积并减少血管内皮功能损害[9]，对动脉粥样硬化等常见心血管疾病有一定的预防和保护作用[10]。本课题组已证实[2,11-13]，当归补血汤可影响糖尿病GK大鼠动脉粥样硬化早期脂质代谢，其机制可能与调节血管中脂质代谢基因Mcp1、Scd1、Fas、Icam1、Cd36有关；同时，黄芪甲苷是当归补血汤吸收入血的7种活性成分之一。此外，我们还发现，当归补血汤可通过改善糖尿病大鼠炎症因子水平，实现对其的正向调控作用。因此，本实验旨在进一步探讨当归补血汤主要活性成分黄芪甲苷通过NLPR3炎性小体调节糖尿病动脉粥样硬化早期大鼠血脂及炎症因子的作用机制，为阐明当归补血汤药效物质基础，扩大其临床应用奠定理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SPF级GK大鼠48只，Wistar大鼠12只，体质量250～300 g，均为雄性，由上海斯莱克实验动物有限公司提供，实验动物许可证号：SCXK(沪)2017-0005。动物饲养于南京中医药大学实验动物中心SPF级屏障环境中，自由摄食、饮水。环境温度为(20±2)℃，环境湿度为(50±5)%，12 h/12 h昼夜模式，每天7:00-19:00保持光照。动物适应性喂养1周后开始实验。实验通过南京中医药大学实验动物伦理委员会批准(批号：202006A028)。

1.2 药材及试剂

黄芪甲苷，购自上海源叶生物科技有限公司，批号：C17J11Q115731；格列喹酮片，购自北京万辉双鹤药业有限公司，批号：1191263；盐酸贝那普利片，购自北京诺华制药有限公司，批号：X3059；戊巴比妥钠，购自德国Merck公司；羧甲基纤维素钠，购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；高脂饲料，购自协同医药生物工程有限责任公司；血糖试纸，购自长沙三诺生物传感股份有限公司；IL-6、IL-10、CRP、TNF-α酶联免疫吸附(ELISA)试剂盒，均购自上海酶联生物科技有限公司；Caspase-1/P20/P10抗体，购自美国Proteintech Group公司；NLRP3抗体、ASC抗体，购自美国Affinity Biosciences公司。

1.3 主要仪器

JA31002型电子精密天平，购自上海舜宇恒平科学仪器有限公司；GA-3型血糖仪，购自长沙三诺生物传感股份有限公司；CL-7200全自动生化分析仪，购自日本岛津公司；GO1510型酶标仪，购自美国赛默飞世尔科技有限公司；DMIL倒置生物显微镜，购自德国Leica公司。

1.4 动物造模及给药

将48只GK大鼠随机分为模型组，阳性药(格列喹酮片联合盐酸贝那普利片)组，黄芪甲苷低、高剂量组，每组12只，均给予高脂饲料诱导早期动脉粥样硬化。12只Wistar大鼠作为空白对照组，给予标准鼠粮。给药组分别灌胃格列喹酮片(10 mg/kg)及盐酸贝那普利片(10 mg/kg)，黄芪甲苷(20、40 mg/kg，以0.5%羧甲基纤维素钠助溶配制成混悬液，终浓度为10 mg/mL)，灌胃体积为10 mL/kg，对照组及模型组灌胃等量生理盐水，每日1次，连续6周。

1.5 体质量、空腹血糖测定

在造模和给药期间，全程监控大鼠体质量及血糖，每隔7 d称体质量，记录并绘制曲线。实验结束后，禁食12 h，用血糖仪测定空腹血糖。

1.6 生化法测定大鼠血清TC、TG、HDL及LDL的含量

实验结束后，将动物禁食12 h，用戊巴比妥钠麻醉并腹主动脉采血。样品1 500×g，4 ℃，离心10 min，得到上层血清，-80 ℃冷冻备用。使用自动分析仪测定血清中TC、TG、HDL、LDL的含量。

1.7 大鼠腹主动脉病理学观察

取大鼠腹主动脉，称质量，并将其固定在10%缓冲福尔马林中。常规方法对腹主动脉进行病理检查，并用苏木精-伊红(HE)染色。进行组织病理学评估，包括确定动脉粥样硬化斑块的面积。

1.8 ELISA法测定大鼠腹主动脉IL-6、IL-10、CRP、TNF-α的含量

采用ELISA法测定大鼠腹主动脉中IL-6、IL-10、CRP、TNF-α的含量，按试剂盒说明书进行测定。

1.9 Western blot法检测大鼠腹主动脉NLRP3、ASC、Caspase-1蛋白的表达情况

将大鼠腹主动脉称质量后，加入RIPA蛋白裂解液匀浆，12 000×g，4 ℃，离心15 min，取上清，测定蛋白浓度后加蛋白上样缓冲液，100 ℃加热变性，-80 ℃备用。根据NLRP3、ASC、Caspase-1的分子量，选择不同浓度制胶，电泳，PVDF转膜，用一抗封闭缓冲液(5%BSA)室温摇床封闭1 h，分别置入加有NLRP3、ASC、Caspase-1抗体稀释液的抗体盒中，4 ℃孵育过夜。次日TBST漂洗3次，加入二抗溶液(羊抗兔二抗)室温孵育1 h，TBST漂洗3次，ECL显色曝光。以β-actin为内参进行半定量计算用于统计分析。

1.10 统计学分析

2 结果

2.1 黄芪甲苷对糖尿病动脉粥样硬化大鼠体质量、空腹血糖的影响

与对照组相比，模型组、阳性药组、黄芪甲苷低剂量和高剂量组大鼠体质量增加无显著差异。与对照组相比，模型组大鼠空腹血糖显著升高(P<0.000 1)；与模型组相比，阳性药组及黄芪甲苷组大鼠血糖均显著降低(P<0.05～0.000 1)，见图1。

注:与对照组比较，####P<0.000 1;与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01，****P<0.000 1。图1 黄芪甲苷对糖尿病动脉粥样硬化大鼠体质量、空腹血糖的影响

2.2 黄芪甲苷对糖尿病动脉粥样硬化大鼠血清TC、TG、HDL及LDL含量的影响

与对照组相比，模型组大鼠血清TC、TG、LDL水平显著升高，HDL水平显著降低(P<0.001～0.000 1)；与模型组相比，阳性药组及黄芪甲苷组大鼠血清TC、TG、LDL水平显著降低，HDL水平显著升高(P<0.05～0.000 1)，见图2。

注:与对照组比较，###P<0.001，####P<0.000 1;与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.000 1。

2.3 黄芪甲苷对糖尿病动脉粥样硬化大鼠腹主动脉病理形态的影响

对照组大鼠未见血栓形成斑块，各主动脉内膜光滑完整。而模型组大鼠出现外膜出血，大量泡沫细胞聚集，导致内膜增厚，平滑肌细胞增生，形成动脉粥样硬化斑块。阳性药及黄芪甲苷组大鼠主动脉外观正常，见图3。

图3 黄芪甲苷对糖尿病动脉粥样硬化大鼠腹主动脉病理形态的影响

2.4 黄芪甲苷对糖尿病动脉粥样硬化大鼠腹主动脉IL-6、IL-10、CRP、TNF-α含量的影响

与对照组相比，模型组大鼠动脉组织中IL-6、CRP、TNF-α水平显著升高，IL-10水平显著降低(P<0.000 1)；与模型组相比，阳性药组及黄芪甲苷组大鼠IL-6、CRP、TNF-α水平均显著降低，IL-10水平显著升高(P<0.01～0.000 1)，见图4。

注:与对照组比较，####P<0.000 1;与模型组比较，***P<0.001，****P<0.000 1。

2.5 黄芪甲苷对糖尿病动脉粥样硬化大鼠腹主动脉NLRP3、ASC、Caspase-1蛋白表达的影响

与对照组相比，模型组大鼠NLRP3、ASC、Caspase-1蛋白表达显著上调(P<0.001～0.000 1)；与模型组相比，阳性药和黄芪甲苷的干预显著下调了大鼠NLRP3、ASC、Caspase-1蛋白的表达水平(P<0.01～0.000 1)，见图5。

注：与对照组比较，###P<0.001，####P<0.000 1;与模型组比较，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.000 1。

3 讨论

众所周知，格列喹酮是临床常用降糖药，盐酸贝那普利对降低患者血脂水平和机体炎性反应有显著疗效[14-15]，因此实验选择二者联合作为阳性药。血脂是糖尿病和动脉粥样硬化发生发展的重要因素，巨噬细胞中胆固醇酯的积累是动脉粥样硬化发病的关键步骤。本研究中，黄芪甲苷可明显改善大鼠动脉损伤，调节异常升高或降低的血脂水平，发挥与盐酸贝那普利类似的功效，提示黄芪甲苷可通过减少脂质积聚，缓解糖尿病动脉粥样硬化。慢性炎症是动脉粥样硬化和糖尿病共同的已知特征。在2型糖尿病患者中，炎症小体活性增加，NLRP3水平升高，促炎细胞因子IL-1β、IL-6、IL-18等水平升高[5]。本研究中，黄芪甲苷可明显降低IL-6、CRP、TNF-α的水平，升高IL-10的水平。IL-6和IL-10可作为较好的抗炎生物标志物，用于慢性炎症性疾病的治疗；CRP是一种急性炎症蛋白，在感染或炎症部位会增加至1 000倍[16]，可作为炎症的衡量指标；TNF-α作为最重要的促炎细胞因子之一，可以促进炎症部位的氧化应激，在炎症、细胞增殖、分化和凋亡过程中对免疫系统起着重要作用[17]。Pedersen的实验证实[18]，在糖尿病结合高脂饮食大鼠模型中，IL-6、CRP、TNF-α水平升高，IL-10水平降低，与本实验研究结果一致。表明黄芪甲苷可通过调控炎症因子的表达，调节糖尿病动脉粥样硬化早期大鼠血脂及炎症因子水平。NLRP3炎性小体是先天免疫系统的重要组成部分，通过NOD样受体NLRP3对有害信号PAMPs、DAMPs作出反应，招募适配蛋白ASC和pro-Caspase-1，从而通过自催化激活Caspase-1，以应对微生物感染和细胞损伤[19]。最近的研究已经证实，NLRP3炎性小体参与动脉粥样硬化发病过程中的炎症反应，而NLRP3基因的沉默可延缓动脉粥样硬化的进展[20]。本研究中，黄芪甲苷可显著下调糖尿病大鼠NLRP3、ASC、Caspase-1蛋白的表达，提示黄芪甲苷可通过调控NLPR3炎性小体相关蛋白的表达，减轻糖尿病动脉粥样硬化早期大鼠炎症状态，保护动脉组织。

综上所述，我们的研究结果表明，黄芪甲苷可调节糖尿病动脉粥样硬化早期大鼠的血脂及炎症状态，实现对动脉组织的保护作用，机制与调控NLPR3炎性小体相关蛋白的表达密切相关。本研究为阐明当归补血汤药效物质基础，扩大其临床应用提供了重要依据。