白首乌中抗肿瘤活性成分告达庭-3-O-β-D-磁麻糖苷在大鼠体内的代谢产物分析

施建丰，彭子萱，彭蕴茹，姚孝明，陈云

(1.南京医科大学免疫学系，江苏 南京 211166；2.江苏省中西医结合医院检验科，江苏 南京 210028；3.新疆医科大学第三临床医学院，新疆 乌鲁木齐 830011；4.江苏省中医药研究院药理毒理学研究室，江苏 南京 210028)

白首乌是传统补益类中药，被历代医家视为养生防老的珍品。近年来，国内外学者对白首乌的药理活性进行了相关研究，证实其具有抗肿瘤、抗衰老、增强免疫、保护肝脏、降血脂等多种功效，而C21甾体是从白首乌中发现的数量最多、也是最主要的活性成分[1]。大量研究表明，白首乌中提取得到的C21甾苷类物质具有显著的抗肿瘤作用[2-6]，国内外学者已从白首乌中分离得到了大量的C21甾苷类成分[7-10]，如白首乌新苷(Cynanauriculoside)A、B、C，耳叶牛皮消苷(Auriculoside)A、B，隔山消苷(Wilfoside)，告达亭，萝藦苷元等化合物。本项目组前期的抗肿瘤活性筛选研究[11]证实从江苏滨海产的白首乌中提取分离得到一种C21甾苷类成分告达庭-3-O-β-D-磁麻糖苷(Caudatin-3-O-β-D-cymaropyranoside，CDMC)，结构如图1所示，研究发现其具有显著的抗肝癌作用，并初步对其抗肿瘤作用机理进行了探讨，证实其抗癌活性与诱导肿瘤细胞凋亡有关[12]。为了更深入地了解此类化合物的作用机理，有必要对其体内过程进行研究，这对于进一步阐明其作用机制和相关药物的后续开发具有指导意义。

图1 CDMC的化学结构式

课题组在前期研究中建立了HPLC-MS/MS方法测定大鼠血浆中CDMC浓度，并且对其在大鼠体内的药代动力学过程进行了初步研究[13]。为了更进一步揭示CDMC的体内过程，本文对其在大鼠体内的可能代谢途径进行初步研究，以期为CDMC的进一步开发提供参考。

1 材料

1.1 样品及试剂

告达庭-3-O-β-D-磁麻糖苷(CDMC)对照品，含量98.4%，由江苏省中医药研究院化学室提取。甲醇、乙腈均为色谱纯，Merck公司；水为Millipore超纯水；其余试剂均为市售分析纯。

1.2 仪器

Waters公司UPLC AcquityTM系统；Waters公司SynaptTMQ-TOF质谱仪，配备Lock-spray接口；电喷雾离子源(ESI)；Waters公司Masslynx 4.1质谱工作站软件，MetaboLynxTM分析软件。

1.3 动物

清洁级SD大鼠，全雄，体质量200～250 g，购于上海斯莱克实验动物有限责任公司，合格证号：SCXK(沪)2007-0005。大鼠饲养于温度(25±2)℃，相对湿度70%，维持12 h光照和12 h黑暗的昼夜节律条件下，自由摄食和饮水，适应1周后用于后续的动物实验。

2 方法

2.1 动物分组及给药

胆汁样品：雄性SD大鼠6只，体质量200～250 g，随机分为空白对照组和给药组，每组3只，用乙醚麻醉后做胆管插管，给药组经十二指肠给予20 mg/kg的CDMC药液，空白组给予等体积的生理盐水，给药后收集24 h内的胆汁，测量体积，于-20 ℃保存待用。

血浆样品：取雄性SD大鼠6只，同法分组和给药，收集给药后24 h内的血浆，于-25 ℃保存待用。

粪便及尿液样品：取雄性SD大鼠6只，同法分组和给药，给药后将大鼠置于代谢笼中，分别收集24 h内的粪便和尿液，于-25 ℃保存待用。

2.2 生物样品前处理方法

血浆样品处理：取大鼠血浆0.3 mL，加入4 mL乙酸乙酯,混旋振荡2 min，离心，吸取3 mL上清，氮气吹干，残渣用100 μL的甲醇溶解，12 000 r/min离心后，取上清进样分析。

胆汁样品处理：取大鼠胆汁0.3 mL，处理方法同血浆样品处理。

尿液样品处理：取大鼠尿液1.0 mL，处理方法同血浆样品处理。

粪便样品处理：取0.5 g大鼠粪便加2 mL的水制成匀浆后，处理方法同血浆样品处理。

2.3 UPLC检测条件

色谱柱为Acquity UPLC©BEH C18(2.1 mm×100 mm，1.7 μm)柱；流动相：乙腈(A)-0.5%乙酸水(B)，梯度洗脱(0 min，3%A；8 min，30%A；15～18 min，95%A；20 min，3%A)；柱温为35 ℃；流速为0.4 mL/min，进样量10 μL。

2.4 MS检测条件

电喷雾离子源，扫描方式为ESI(+/-)模式，毛细管电压为2.3 kV，锥孔电压为10 V，离子源温度：120 ℃，锥孔气流量为50 L/h，脱溶剂气温度：350 ℃，脱溶剂气流量为600 L/h，离子能量：1 V，碰撞能量：20～50 V；采用亮氨酸-脑啡肽(Leucine-enkephalin，ESI+：m/z556.277 1，ESI-：m/z555.261 5)溶液为锁定质量溶液。质量扫描范围为m/z100～1 000，数据采集方式和模式：centroid与MS，数据分析：质量亏损过滤(MDF)。

2.5 MetabolynxTM处理设置

将CDMC的Ⅰ相、Ⅱ相代谢途径可能产生的代谢物列入表1，输入MetabolynxTM软件Metabolite List窗口中，质谱数据检测误差范围<10 mDa，并将质量亏损过滤(DMF)应用于数据处理。

表1 Metabolite List窗口设置的可能的Ⅰ相、Ⅱ相代谢途径

3 结果

3.1 含药样品的UPLC-Q-TOF-MS分析

CDMC为甾体皂苷，且含糖苷，其在负离子模式下，具有较好的质谱响应。前期预试验分别在正、负离子模式下对CDMC样品进行分析，结果发现待测样品在正离子条件下峰较小，信号强度小，而负离子响应较好，所以选择负离子对其进行分析。图2为空白样品与含药样品的负离子条件下的总离子流图。

A.血浆；B.尿液；C.粪便；D.胆汁;Blank.空白组；Sample.样品

3.2 MetabolynxTM软件处理结果

利用MetabolynxTM软件寻找CDMC的目标代谢物，其可能发生的代谢途径如表1中所设，经MetabolynxTM软件处理后大鼠血浆、尿液、粪便、胆汁中的CDMC及其代谢产物的MetabolynxTM软件处理结果报告见表2，图3～4。

表2 CDMC及其代谢物MetabolynxTM软件处理结果

注：A.尿液；B.血浆；C.粪便；D.胆汁

3.3 原型成分及代谢物的鉴定

3.3.1 原型化合物的鉴定 化合物M1(TR=12.66 min)：经MetabolynxTM软件处理，处理结果如图3，大鼠含药尿液ESI-图中TR为12.66 min处存在m/z633.35峰的化合物，此成分在MSE图中(图4)有m/z633.35、505.27、325.18、127.06峰，认为m/z633.35[M-H]-为分子离子峰，其余为其主要碎片离子峰，Mass Fragment分析结果如图4，与CDMC对照品相同，由此确定其为CDMC。

图4 CDMC的碎裂途径

3.3.2 代谢物的鉴定 化合物M2(Rt=7.66 min)：经MetabolynxTM软件处理，大鼠含药血浆、胆汁ESI-图中TR为7.66 min处存在m/z为523.29峰的化合物，此成分在MSE图中有m/z523.29，507.29[M-O]，363.21[M-C7H12O4]峰，其中m/z523.29[M-H]-为分子离子峰，其余为其主要碎片离子峰，可以推测其为CDMC的水解产物。

化合物M3(TR=8.33 min)：经MetabolynxTM软件处理，大鼠含药粪便ESI-图中TR为8.33 min处存在m/z605.32峰的化合物，此成分在MSE图中有m/z605.32，589.33[M-O]峰，认为m/z605.32[M-H]-为分子离子峰，其余为其主要碎片离子峰，可以推测其为CDMC去2个甲基化产物。

化合物M4(TR=9.78 min)：经MetabolynxTM软件处理，大鼠含药胆汁ESI-图中TR为9.78 min处存在m/z619.34峰的化合物，此成分在MSE图中有m/z619.34，603.35[M-O]峰，认为m/z619.34[M-H]-为分子离子峰，其余为其主要碎片离子峰，可以推测其为CDMC去1个甲基化产物。

化合物M5(TR=10.98 min)：经MetabolynxTM软件处理，大鼠含药胆汁ESI-图中TR为10.98 min处存在m/z591.30峰的化合物，此成分在MSE图中有m/z591.30，575.31[M-O]峰，认为m/z591.30[M-H]-为分子离子峰，其余为其主要碎片离子峰，可以推测其为CDMC去3个甲基化产物。见图5。

图5 CDMC在大鼠体内可能的代谢产物

4 讨论

碳二十一甾苷是白首乌中的主要代表性活性成分，其活性主要有抗肿瘤、免疫调节、降血脂及保肝等。大量文献报道表明，甾苷类成分大多口服吸收较差，生物利用度不高，通常会在体内发生广泛的代谢和生物转化，因此，研究其体内代谢转化对于揭示此类化合物的药理作用机制有重要意义。课题组在前期研究中发现，白首乌中碳二十一甾苷类成分CDMC在体内外均具有明显的抗肿瘤作用，但其口服给药后在大鼠体内的血药浓度较低，推测其口服后有可能在体内发生了代谢转化。本实验研究发现，CDMC在大鼠体内存在原型、水解及去甲基化代谢物，其主要代谢物均为去甲基化代谢物。虽然文献报道很多去甲基代谢多发生在N或O上，但本研究中CDMC的去甲基代谢却在C上，说明此化合物代谢转化过程与其他类物质有所不同。经文献对比，发现也有学者在研究中发现有化合物的去甲基代谢发生在C上，比如人参皂苷Rg5在大鼠血浆及粪便中均发现其去甲基化代谢产物[14]，其去甲基就发生在C上。人参皂苷和CDMC虽属于不同类型成分，但均属于皂苷类物质，此结果提示皂苷类成分在体内的代谢途径可能有相似之处，并且与其他化合物的体内代谢转化方式有所不同。皂苷类成分与其他类型的天然产物如生物碱类、萜类等成分不同之处是，大多皂苷类成分口服后其原形成分的生物利用度较低，而胃肠道代谢产物是其吸收入血的主要形式[15]，并且肠道菌群在其代谢转化过程中起非常重要的作用。本项目组曾对CDMC在人体肠道菌孵育液中的代谢产物进行研究，发现其主要代谢产物包括水解产物、氢化产物、去甲基化产物、羟基化产物、去糖基化产物等[16]。在肠道菌群介导的皂苷类代谢反应中，水解脱糖是最主要的代谢方式。CDMC在人体肠道菌孵育液中的体外代谢产物中即发现其苷元告达庭，有报道表明此苷元即具有较强的抗肿瘤活性[17-18]。体外结果可提示CDMC有可能通过肠道菌群介导的水解脱糖生成具有较强生物活性的苷元，从而继续发挥药理活性。与体外实验相比较，本研究在大鼠体内发现了较少的代谢产物，有可能是由于大鼠体内代谢物浓度较低，也有可能是体内与体外代谢存在差异的原因，还有可能是由于大鼠与人不同种属间肠道菌群及代谢酶有所不同所导致，其具体原因后续可继续深入探讨。但CDMC体内、体外代谢途径相一致的即为其去甲基化产物，提示去甲基化代谢途径可能是其重要的一种代谢转化方式。相类似的去甲基化代谢产物也同样在其他皂苷代谢过程中被发现，如α-常春藤皂苷[19]、白头翁皂苷B3[20]等，其内在关联还有待进一步研究。

此外，虽然目前的研究报道中关于药物代谢酶参与天然皂苷类成分体内代谢的研究相对较少，更多的文献[21]支持此类物质主要在胃肠道中经肠道菌群转化而降解吸收入血发挥药理活性，但关于此类成分体内代谢与药物代谢酶之间的相关性仍值得深入探讨。