滤泡辅助性T细胞（Tfh）和激活B细胞在帕金森病患者外周血中的水平及意义①

阴育红 金 鑫 王国辉（佳木斯市中心医院神经内科，佳木斯154002）

帕金森病（Parkinson's disease，PD）是一种神经系统变性疾病，临床表现以静止性震颤、肌强直、运动迟缓及姿势反射障碍为主［1］。目前较多的研究证明PD的发病与免疫有关，表现为黑质中大量组织相容性糖蛋白小胶质细胞的表达［2-3］。而PD患者外周血中细胞免疫和体液免疫也存在异常，目前，PD中的免疫异常究竟是原发还是继发尚不明确。细胞免疫中存在细胞毒类T细胞、B细胞、调节性T细胞等，在既往研究中已经发现辅助性T细胞亚群在PD外周血中水平异常，且与炎症反应有关［4-5］。滤泡辅助性T细胞（follicular helper T cells，Tfh）是一种新型辅助性T细胞亚群，在B细胞的增殖、分化中具有重要作用，而Tfh水平与自身免疫性疾病和免疫异常疾病有关。有研究报道在自身免疫性疾病中Tfh扮演重要的推手作用，尤其是强直型脊柱炎活动期存在高水平的Tfh［6-7］。本研究以PD免疫失调为根据，主要研究在PD患者外周血中Tfh的水平与相关的激动B细胞、细胞因子的表达水平，探究Tfh在PD发病进展中的作用。

1 资料与方法

1.1 资料

1.1.1 研究对象 选择2016年1月至2017年12月于我院神经内科就诊并确诊为PD的患者73例。入组标准：①符合2016版中国PD诊断标准［8］；②患者未患有感染性疾病，外周血生物指标检查未见炎性指标异常；③患者自愿入组，依从性良好；④无神经系统疾病史。排除标准：①患者具有脑卒中、脑外伤、脑膜炎病史；②患者入院时具有感染性疾病，外周血生物指标检查中炎性指标异常；③患者有痴呆伴记忆力、语言、行为障碍；④无法配合检查和治疗。在最终入组的73例中，包括男性45例，女性28例。年龄55～82岁，平均年龄（65.3±5.3）岁，病程1～8年。按照Hoehn-Yahr分期法分为Ⅰ期22例、Ⅱ期24例，Ⅲ期15例，Ⅳ期12例，Ⅴ期0例。选择同期的健康志愿者20例（control组），其中男性12例，女性8例，年龄45～75岁，平均年龄（58.3±6.3）岁，身体情况良好。本研究通过我院伦理委员会批准，所有研究对象均知情同意并签署知情同意书。

1.1.2 主要试剂与仪器 人淋巴细胞分离液（上海华精生物高科有限公司）；FITC-CD4、APC-CXCR5、PE-ICOS、PE-CD19、FITC-CD83流式抗体（美国eBio-Science公司）；BCA试剂盒（武汉博士德生物技术有限公司）；ELISA试剂盒（南京建成生物科技有限公司）；TRIzol试剂（BioTeKe公司）；实时荧光定量PCR试剂盒（Sinobio公司）。

1.2 方法

1.2.1 外周单个核细胞的提取所有受试患者及健康志愿者均禁食12 h后抽取肘静脉外周血5 ml，置于EDTA抗凝管，1 h内提取单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMC）。具体方法为：无菌条件下以1 500 r/min离心外周血15 min，弃去上层血清，在血细胞沉淀中加入生理盐水15 ml，均匀吹打后加入10 ml人淋巴细胞分离液，300 r/min离心30 min，小心吸取中间的单个核细胞层，转移至干净无菌管，1 500 r/min离心10 min，PBS清洗2次后备用，待检测。

1.2.2 单个核细胞内Tfh和激活B细胞比例的检测 将得到的单个核细胞随机分为2份，其中1份进行CD4+CXCR5+ICOS+Tfh细胞检测，在PBMC加入FITC-CD4、APC-CXCR5、PE-ICOS的 流 式 抗体 各10μl，充分混合后，避光孵育20 min，加入流式洗涤液2 ml混匀后，PBS清洗2次后上机检测；另1份PBMC检测CD83+CD19+激活B细胞，加入PE-CD19、FITC-CD83的流式抗体避光孵育20 min后，加入裂解液混匀后避光15 min，PBS清洗2次后上机检测。标本同时使用同型对照。

1.2.3 ELISA法检测血清IL-21的表达 收集提取的单个核细胞血清，使用BCA试剂盒进行蛋白质定量，调整浓度后，参照ELISA试剂盒说明检测。

1.2.4 RT-qPCR检测PBMC中Bcl-6、IL-21、IL-4的mRNA水平 收集PBMC细胞，PBS清洗2～3次后加入1 ml TRIzol试剂裂解15 min，加入三氯甲烷1 ml，低温下12 000 r/min离心15 min，加入等体积异丙醇混合后，静置10 min，低温下12 000 r/min离心15 min后取沉淀，紫外分光光度计检测RNA纯度（吸光度0.8～1.0），按照实时荧光定量PCR试剂盒说明书操作检测Bcl-6、IL-21、IL-4的mRNA表达水平。引物序列见表1。

1.3 统计学处理 应用SPSS20.0软件进行统计学分析。符合正态分布的计量资料采用±s表示，组间比较采用单因素方差分析，组内进一步两两比较采用独立样本t检验。P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 PBMC中Tfh和激活B细胞水平的检测结果PD患者外周血中Tfh细胞比例［（3.20±0.41）%］和B细胞比例［（3.69±0.58）%］显著高于健康人外周血［（1.02±0.18）%、（1.17±0.21）%，P=0.000，0.000，t=8.124，6.547 2］，且Tfh和B细胞比例具有相关性（r=0.638，P=0.000）。而PD患者Ⅰ期～Ⅳ期外 周 血 中Tfh的 比 例 为（1.35±0.52）%、（2.65±0.33）%、（4.52±0.62）%和（5.95±0.68）%，与健康人相比，差异具有统计学意义（P=0.000、0.000、0.000、0.000，t=4.125、6.854、10.334、13.142）；B细胞比例为（2.08±0.55）%、（3.18±0.23）%、（4.96±0.58）%和（6.03±0.66）%，与健康人相比，差异具有统计学意义（P=0.000、0.000、0.000、0.000，t=5.982、8.214、10.224、15.214）。结果见图1、2。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequence

图1 外周血PBMC中Tfh和激活B细胞Fig.1 Tfh and activated B cells in PBMC of peripheralblood

图2 Tfh细胞和激活B细胞在PD分期中的水平Fig.2 Levels of Tfh cells and activated B cells in staging of PD

2.2 PD患者外周血中IL-21的表达水平 Control组外周血中IL-21水平为（12.52±2.11）pg/ml，PD组外周血中IL-21水平为（19.31±2.87）pg/ml，二者差异具有统计学意义（P=0.000，t=9.362）。而在PD分期中，IL-21的水平随分期增高而增高，相比control组差 异 具 有 统 计 学 意 义（P=0.000、0.000、0.000、0.000，t=6.542、8.241、11.346、15.213）。见图3。

2.3 PBMC中Bcl-6、IL-21、IL-4的mRNA水平 Control组外周血中Bcl-6、IL-21、IL-4的mRNA水平分别为（0.18±0.03）、（0.23±0.05）、（0.20±0.04），低于PD患 者 外 周 血 的（0.36±0.06）、（0.48±0.05）、（0.51±0.08），差异具有统计学差异（P=0.000、0.000、0.000、t=8.357、9.134、12.521）。且随着分期增高，Bcl-6、IL-21、IL-4的mRNA水平显著增高。见图4。

图3 外周血中IL-21的表达水平Fig.3 Expression of IL-21 in peripheral blood

图4 PBMC中Bcl-6、IL-21、IL-4的mRNA水平Fig.4 mRNA levels of Bcl-6，IL-21 and IL-4 in PBMC

3 讨论

PD是一种中脑黑质多巴胺（dopamine in substantia nigra，DA）能神经元进行性变性、缺失、死亡的疾病［9］。目前氧化应激损害、钙离子细胞毒性作用及兴奋性氨基酸毒性是DA能神经元凋亡的主要学说，也是导致PD的主要原因［10］。但这些学说还无法完全揭示DA能神经元的损害，可能还有其他因素参与，因此近年来PD与免疫的关系逐渐被揭示。T淋巴细胞是主要的细胞免疫功能细胞，多项研究发现，PD患者外周血中存在T淋巴细胞亚群的改变，其中CD4+CD25+T细胞比例下降，而记忆T细胞比例增高，且γδ+T细胞显著增高。由于CD4+CD25+T细胞和γδ+T细胞对于免疫功能的调节具有重要作用，二者的比例失调可导致免疫功能的失调［11-12］。Tfh是一种负责辅助B细胞的CD4+T细胞亚群，可以特异性表达CD40、诱导性协同刺激分子（ICOS）、CXCR5、BCl-6，分泌IL-21，在刺激B细胞增殖、分化及免疫球蛋白的转换过程中发挥重要作用［13-15］。有研究表明，IL-21的缺失可导致Tfh水平下调，IL-21是Tfh产生和功能执行的关键因子，通过直接作用Tfh或间接作用Bcl-6等调节Tfh的分化，IL-21还可通过上调CXCR5表达促进Tfh向B淋巴滤泡迁移，促进B细胞的激活和增殖［16］。根据现有研究报道，Tfh和自身免疫疾病密切相关。对AIRE的研究中发现，MG患者外周血中CXCR5+CD4+T细胞比例显著增高，且与疾病严重程度相关，ICOS介导淋巴细胞共刺激对诱导体液免疫产生AchR和发生EAMG非常重要［17］。在系统性红斑狼疮的研究中发现，B细胞的活化依赖于Tfh的介导，其中ICOS途径可增强Tfh的细胞功能，CXCL3和IL-21可作为促炎因子提高机体炎症水平，尤其是活动期系统性红斑狼疮，其IL-21的水平显著高于静止期［18］。在炎症性肠病的发病中发现，Tfh异常活化可导致大量的IL-21分泌，同时IL-21与受体结合可诱导外周血及黏膜固有淋巴层中大量促炎因子的释放，IL-21还可通过Th1细胞反应调节肠黏膜组织单个淋巴细胞增殖，分泌高水平的炎症因子［19］。现有的研究表明，Tfh在免疫性炎症反应中发挥重要作用，其作用机制与B细胞的激活及IL-21的分泌有关。

本研究结果显示，PD患者外周血中Tfh比例增高，且与正常人相比，差异具有统计学意义，Tfh的比例随PD分期增高而增高，且具有统计学意义。IL-21作为Tfh分化及功能的关键细胞因子，同样在PD中高表达，且与H-Y分期相关。Tfh介导的炎症作用与B细胞的激活有关，从结果看，PD患者中激活B细胞的比例显著高于健康人，而激活B细胞比例随分期增高显著增高，说明在PD患者中存在Tfh的过度增殖和B细胞的过度激活，IL-21在Tfh和B细胞的相互作用中起重要作用。