同卵、异卵、非双胞胎外周血TCRβ链假基因和功能性CDR3受体库前后5年动态变化分析①

苏丹华 董晓衡 贺晓燕 王小妹 马 锐 马 龙 姚新生（遵义医科大学免疫教研室贵州省基因检测治疗与特色重点实验室，贵州省免疫分子工程研究中心，遵义563000）

T细胞受体（αβ异二聚体）通过识别抗原提呈细胞提呈的主要组织相容性复合体（MHC）-抗原肽复合物参与机体的适应性免疫应答［1］。影响个体外周T细胞TCR受体库的主要因素包括：①TCR初始重组中各V（D）J基因的取用和配对；②胸腺中TCR自身耐受过程中的选择；③外周环境中TCR应答的克隆增生。

多项研究证实，T/B细胞在进行自身抗原选择前的V（D）J重组并非“随机”，如重组信号序列（RSSs）中的七聚体/九聚体保守性［2］；12 bp/23 bp间隔子的序列和长度［3-4］；V（D）J基因片段的近端/远端间距等［5-6］，均会造成T/B细胞在自身抗原耐受选择前受体库的特征性差异，提示个体遗传因素对V（D）J重组中的偏向性作用。T细胞在初始重排后，在胸腺中与MHC-自身抗原进行耐受选择，输出到外周并形成个体初始独特的T细胞受体库［1，7-9］。

人双胞胎是研究T细胞受体库差异形成机制的最适研究对象，早期采用CDR3谱系等技术研究同卵双胞胎T细胞受体库的特征，发现同卵双胞胎在肿瘤、自身免疫病等疾病中，TCR受体库存在部分同质性［10-14］。随着高通量测序技术在T/B细胞受体库解析中的应用，ZVYAGIN等［15］、RUBELT等［16］、MAYER等［17］、JIANG等［18］、HEIKKILÄ等［19］利 用TCRCDR3受体库的数据探讨同卵双胞胎TCR受体库的差异性和免疫特性的差异性，总体结果提示同卵双胞胎V、D、J取用的相似性表明了遗传因素在重组过程中的重要性。总体上，在目前探讨双胞胎的特异遗传因素对T细胞（或B细胞）V（D）J重排的影响研究中，提示框架外重排CDR3受体库和遗传因素密切相关，而功能性CDR3受体库因受到复杂环境因素的影响，其体内研究存在一定困难，这些初步的研究为TCR的经典随机重排理论中可能和“遗传”存在联系的研究提供基础［20］。

假基因重排后形成的CDR3序列不参与自我耐受的选择和外界环境中的免疫应答，理论上更能反映个体遗传因素对V（D）J重排的影响［21-24］。本实验对比分析同卵、异卵和非双胞胎的TCRβ链外周血假基因CDR3受体库、功能性CDR3受体库前后5年的动态变化，以分析双胞胎假基因CDR3受体库为创新点，为进一步解析个体遗传因素对V（D）J重组、耐受选择和适应性应答的效应和机制提供基础。

1 资料与方法

1.1 资料 两对同卵双胞胎和一对异卵双胞胎健康志愿者基本信息见网络版附表1（http://www.immune99.com），本实验获得3对双胞胎志愿者知情同意并获得遵义医科大学伦理委员会批准。

1.2 方法

1.2.1 DNA样本制备 2012年和2017年分别采集3对健康双胞胎志愿者（A、B、c）的外周血各10 ml（2012年的采集由课题组完成），实时分离外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMCs）并提取总DNA，以总DNA为模版进行TCRβCDR3建库。

1.2.2 HLA分型检测 将3对双胞胎志愿者的DNA样本送至北京博奥晶典生物技术有限公司进行HLA分型检测。

1.2.3 TCRβCDR3受体库的构建和测序 设计合成人TRBV基因家族上游引物30条，TRBJ下游引物14条，GAPDH对照上下游引物2条，由上海英潍捷基生物技术有限公司（上海）合成（网络版附表2、3、4，http://www.immune99.com）。2012年将3对双胞胎DNA样本送至美国华盛顿医院（美国华盛顿），采用多重PCR技术，建立TCRβCDR3受体库。2017年将3对双胞胎DNA样本送至华大基因（湖北武汉），采用多重PCR技术，构建TCRβCDR3受体库，2012和2017年均采用Illumina Solexa高通量技术对各样本的TCRβCDR3受体库进行测序。

1.2.4 数据分析和统计分析 将高通量测序的CDR3序列转换为FASTA格式并上传IMGT数据库，对IMGT下载的数据进行筛选：①筛除“No results”序列；②筛除“Unkown functionality”序列；③筛除“Warnings”序列；④筛除“Junction frame=null”序列；⑤筛除104位不是“cysteine，C”或118位不是“Phenylalanine，F”的氨基酸序列。将筛选的CDR3序列分为假基因CDR3序列和功能性CDR3序列，本文所有图均用Pseudogene CDR3表示假基因CDR序列，Productive CDR3表示功能性CDR序列。采用Excel软件、IMGT/HighV-QUEST（http：//www.imgt.org）软件、Graphpad Prism8.0软件、Heml、SPSS22（配对T检验）和Draw Venn Diagram在线软件工具等分析每个样本。a.克隆增殖分析（多样性分析）：采用反辛普森指数（the inverse Simpson′s diversity index，1/DS）分析功能性CDR3受体库的克隆增殖，计算公式为1/DS=1/∑｛ni×（ni-1）｝/｛n×（n-1）｝，ni指第i条序列的总数，1/DS数值越高则多样性越丰富，独特序列的频率按从高到低进行排序，Y轴用Log10来展现频率大小［25-26］。b.基因取用分析：TRBV/TRBJ基因家族前后5年的取用频率变化。c.V-J配对：V（D）和J连接或V和（D）J连接。c.核苷酸剪切与插入：在V（D）J连接处有核苷酸的剪切与插入。d.CDR3长度和AA取用：TCRβCDR3区有不同长度的AA序列，用不同长度的氨基酸序列表征CDR3长度；CDR3区不同氨基酸的取用频率不同。e.前后5年Overlap重叠：将个体内前后5年重叠的氨基酸数目、同卵双胞胎之间前后5年重叠的氨基酸数目、异卵双胞胎之间前后5年重叠的氨基酸数目进行标准化分析，两个个体之间重叠的数目为a，两个个体各自独特的氨基酸数目为M和N，标准化的方法为a/M×N，并将标准化的重叠进行统计分析［8］。

本研究2012年和2017年采集的3对双胞胎分为5年前（A1-2012、A2-2012、B1-2012、B2-2012、c1-2012、c2-2012）和5年后（A1-2017、A2-2017、B1-2017、B2-2017、c1-2017、c2-2017），采用配对T检验对双胞胎前后5年进行统计，对比分析同卵双胞胎（A1/A2，B1/B2），异卵双胞胎（c1/c2）和非双胞胎（A1/B1，A1/c1，A1/c2，B1/c1，B1/c2）TCRβ CDR3受体库前后5年的动态变化。以下图中分别用MZ（monozygotic，MZ）代表同卵双胞胎，DZ（dizygotic，DZ）代表异卵双胞胎，NT（non twins，NT）代表非双胞胎。*代表P＜0.05，**代表P＜0.01，***代表P＜0.001。

2 结果

2.1 3对双胞胎志愿者的HLA分型 根据HLA定型，A1/A2，B1/B2是同卵双胞胎；c1/c2是异卵双胞胎。对同卵双胞胎具有相同的MHC等位基因谱，1对异卵双胞胎至少有1个不同的MHC等位基因谱（表1）。

2.2 3对双胞胎志愿者前后5年TCRβCDR3受体库数目 3对双胞胎志愿者前后5年高通量测序（high throughput sequencing，HTS）的TCRβ链假基因CDR3序列、功能性CDR3序列中的unique/total数目和比例见网络版附表5、6（http://www.immu ne99.com）。

2.3 3对双胞胎志愿者TCRβ链功能性CDR3受体库前后5年多样性分析 3对双胞胎前后5年的克隆增殖情况差异（图1A），且前后5年的1/DS差异无统计学意义（图1B）。

2.4 同卵、异卵和非双胞胎TCRβCDR3受体库TRBV/TRBJ基因家族频率、V-J配对前后5年对比分析TRBV基因取用：在TCRβ链假基因CDR3受体库中，TRBV2 1-1和TRBV3-2基因家族频率在前后5年有统计学差异（图2A），且在同卵双胞胎之间前后5年变化一致（图2B、C），但在异卵双胞胎之间和非双胞胎之间前后5年变化不一致（图2D～I）。在TCRβ链功能性CDR3受体库中，10/48个TRBV基因家族取用频率前后5年有统计学差异，45/48个基因家族（2对双胞胎的均值）取用频率在同卵双胞胎之间前后5年变化一致（网络版附图1B、C，http://www.immune99.com），43/48个基因家族取用频率在异卵双胞胎之间前后5年变化一致（网络版附图1D，http://www.immune99.com）。45/48个基因家族（5对异卵双胞胎均值）取用频率在非双胞胎之间前后5年变化一致（网络版附图2，http://www.immune99.com）。以上结果提示，假基因CDR3受体库中同卵双胞胎之间TRBV的动态变化更为一致。

TRBJ基因取用：在TCRβ链假基因CDR3受体库中，2/14个TRBJ基因家族取用频率前后5年有统计学差异，10/14个TRBJ基因家族取用频率在同卵、异卵和非双胞胎之间前后5年变化一致（图3）。在TCRβ链功能性CDR3受体库中，5/14个TRBJ基因家族取用频率前后5年有统计学差异，9/14个TRBJ基因家族取用频率在同卵双胞胎之间、异卵双胞胎之间、非双胞胎之间前后5年变化一致（网络版附图3，http://www.immune99.com）。以上结果提示，TCRβ链假基因CDR3序列和功能性CDR3序列中，TRBJ的动态变化在同卵、异卵和非双胞胎之间相似。

表1 3对双胞胎HLA-A、B、C和DRB1基因分型结果Tab.1 HLA-A，B，C and DRB1 genotyping results of 3 pairsof twins

V-J配对：聚类分析的枝长越短，表示个体之间越相似。在TCRβ链假基因CDR3受体库中，同卵双胞胎之间前后5年差异最相似，异卵双胞胎次之，非双胞胎之间随机分布（图4A）；在TCRβ链功能性CDR3受体库中，同卵、异卵和非双胞胎前后5年差异随机分布（图4B）。

图2 同卵、异卵和非双胞胎TCRβ链假基因CDR3受体库TRBV基因取用前后5年对比分析Fig.2 Comparison for TRBV gene usage of TCRβchain pseudogene CDR3 repertoires before and after 5 years among MZ，DZ and NT

2.5 同卵、异卵和非双胞胎TCRβCDR3受体库核苷酸插入和删除前后5年对比分析 本实验将同卵、异卵和非双胞胎前后5年插入和删除的核苷酸平均数目进行分析。在TCRβ链假基因CDR3受体库中，VD insertions、V deletions和Jdeletions的平均数目前后5年具有统计学差异（图5A），但在同卵双胞胎之间前后5年变化一致（图5B、C），VD insertions、V deletions的平均数目在异卵双胞胎之间和非双胞胎之间前后5年变化不一致（图5D～I）。在TCRβ链功能性CDR3受体库中，VD insertions、DJ insertions、V deletions和Jdeletions的平均数目前后5年具有统计学差异（网络版附图4A，http://www.immune99.com），但其5年动态变化在同卵、异卵和非双胞胎之间无显著差异（网络版附图4B～I，http://www.immune99.com）。

图3 同卵、异卵和非双胞胎TCRβ链假基因CDR3受体库TRBJ取用前后5年对比分析Fig.3 Comparison for TRBJ gene usage of TCRβchain pseudogene CDR3 repertoires before and after 5 yearsamong MZ，DZ and NT

图4 同卵、异卵和非双胞胎TCRβCDR3受体库V-J配对5年差异的聚类分析Fig.4 Cluster Analysis for V-J pairing 5-year differences of TCRβCDR3 repertoires among MZ，DZ and NT

图5 同卵、异卵和非双胞胎TCRβ链假基因CDR3受体库核苷酸插入与删除平均数目前后5年对比Fig.5 Comparison for average number of nucleotides insertions and deletions of TCRβchain pseudogene CDR3 repertoires before and after 5 years among MZ，DZ and NT

图6 同卵、异卵和非双胞胎和个体内TCRβCDR3受体库前后5年标准化的Overlap统计Fig.6 Statistics of Overlap normalized of TCRβCDR3 repertoires before and after 5 years among MZ，DZ，NT and within donor

2.6 同卵、异卵和非双胞胎TCRβ链功能性CDR3受体库AA取用以及AA长度前后5年分析 同卵、异卵和非双胞胎CDR3受体库的AA取用和AA长度分布前后5年差异随机分布（网络版附图5，http://www.immune99.com）。

2.7 同卵、异卵和非双胞胎TCRβCDR3受体库Overlap前后5年分析 在TCRβ链假基因CDR3受体库和功能性CDR3受体库中，个体内前后5年的Overlap比率大于同卵双胞胎、异卵双胞胎和非双胞胎前后5年的重叠比率，同卵、异卵和非双胞胎之间前后5年的Overlap比率无统计学差异（图6和网络版附图6、7，http://www.immune99.com）。

3 讨论

人双胞胎更适合探讨遗传和环境因素影响机体的生理和病理机制［27］。在T细胞适应性免疫应答效应和机制的差异性研究中，早期采用CDR3谱型分析技术，发现在肿瘤、感染、自身免疫病的T细胞应答受体库中，同卵双胞胎之间存在一定的同质性［10］。在个体遗传因素对T细胞受体库初始重排和胸腺耐受选择的影响研究中，ZVYAGIN等［15］的结果显示，3对同卵双胞胎内αβTCR的V基因取用在in frame和out of frame中都表现出高度相似性，而α链的J基因取用在out of frame中与遗传关系不大，但在in frame中双胞胎表现出高度相关性。RUBELT等［16］量化了遗传因素对V（D）J重组过程和胸腺选择的影响，发现V（D）J取用和N/P长度的偏差导致CDR3区域的显著变化。HEIKKILÄ等［20］研究发现，框架外重排CDR3和功能性CDR3序列中的V/J基因取用及框架外重排CDR3序列的Overlap存在遗传偏向性，而CDR3的AA长度分布及非模板核苷酸的插入比较随机。

因获取人类胸腺和外周T细胞受体库的样本对照研究有一定困难，个体遗传因素对人T细胞受体库的初始重排和胸腺中耐受选择的具体效应和详细机制的阐明，有待在双胞胎等特殊研究对象中获取更多研究数据。本实验以同卵、异卵和非双胞胎为研究对象，采用HTS技术详细对比分析TCRβ链假基因CDR3受体库和功能性CDR3受体库前后5年的动态变化，研究主要发现：

（1）同卵、异卵和非双胞胎外周血总T细胞TCRβ链功能性CDR3受体库前后5年的克隆增殖（多样性）分析发现，前后5年的克隆增殖情况无显著差异，且前后5年的1/DS无统计学差异。经回访，5年期间双胞胎A、B、c彼此之间生活在同一城市。个体外周血总T细胞受体库多样性除了源于基因片段的组合多样性和核苷酸插入与删除的连接多样性，还与年龄、环境应答等多种因素密切相关［28］。而基因片段的组合与核苷酸的插入和删除在重组阶段完成，且ZVYAGIN等［15］和RUBELT等［16］的结果提示核苷酸的插入和删除有遗传偏向性。本研究提示在健康双胞胎之间的环境没有显著不同的情况下，外周血总T细胞TCRβ链功能性CDR3受体库的多样性在前后5年无显著差异。

（2）同卵、异卵和非双胞胎TCRβCDR3受体库TRBV/TRBJ基因家族频率、V-J配对前后5年对比分析发现，在TCRβ链假基因CDR3受体库中，TRBV21和TRBV3-2取用频率前后5年具有统计学差异，且在同卵双胞胎之间前后5年变化一致；而TRBJ基因家族取用频率前后5年的动态变化在同卵、异卵和非双胞胎之间无显著差异；在TCRβ链功能性CDR3受体库中，TRBV/TRBJ基因家族取用频率前后5年的动态变化在同卵、异卵和非双胞胎之间无显著差异。TCRβ链假基因参与重排形成的无功能的CDR3序列，间接或被动地参与中枢选择（假基因重排，导致另一条染色体重排参与中枢选择），因此更能用于表征初始重组和胸腺选择后的T细胞初始库［21-24］。ZVYAGIN等［15］和RUBELT等［16］的结果提示，T细胞初始重排阶段TRBV/TRBJ基因取用具有遗传偏向性。本研究提示TCRβ链假基因CDR3受体库中，TRBV基因取用前后5年的动态变化受遗传因素调控，而TRBV基因家族（功能性CDR3受体库）及TRBJ基因家族（假基因CDR3受体库和功能性CDR3受体库）前后5年的动态变化与遗传因素关系不密切，本实验的结果与ZVYAGIN等［15］和RUBELT等［16］的结果部分一致（TRBV基因），更进一步地证实了个体遗传因素对T细胞TRBV基因的偏向性等效应，而功能性CDR3受体库受到环境因素影响，可能是环境因素削弱了同卵、异卵和非双胞胎之间的差异。

本实验进一步分析TCRβCDR3受体库V-J配对前后5年的动态变化发现，在TCRβ链假基因CDR3受体库中，同卵双胞胎之间前后5年动态变化最相似，异卵双胞胎次之；在TCRβ链功能性CDR3受体库，同卵双胞胎、异卵双胞胎和非双胞胎前后5年动态变化无显著差异。

假基因CDR3受体库可表征胸腺选择之前的TCR受体库，而最初的重排中，调控V-D-J配对选择的因素非常复杂，V-J的配对取用与个体遗传因素相关的七聚体/九聚体的保守性、12/23间隔、V-D-J之间的间距等“调控”因素相关［2-6］。本部分实验结果提示，在5年期间假基因CDR3受体库中，V-J配对的变化受遗传因素调控，进一步提示了遗传因素对V-J配对的调控作用。

（3）同卵、异卵和非双胞胎TCRβCDR3受体库核苷酸插入和删除前后5年对比分析发现，在TCR β链假基因CDR3受体库中，核苷酸插入与删除的平均数目在同卵双胞胎之间前后5年变化更一致；在TCRβ链功能性CDR3序列中，同卵、异卵和非双胞胎之间无显著差异。CDR3受体库的多样性除了与参与V（D）J基因家族的重组有关，其进一步的多样性是由于在V→D（N1）和D→J（N2）的连接处添加了“N”核苷酸，核酸外切酶修剪（3′V trimmed，5′D trimmed，3′D trimmed and 5′Jtrimmed）并添加回文“P”核苷酸（P3′V，P5′D，P3′D and P5′J）。VD insertions=P3′V+N1+P5′D；DJ insertions=P3′D+N2+P5′J；V deletions=3′V trimme；D5 deletions=5′D trimmed；D3 deletions=3′D trimmed；Jdeletions=5′Jtrimmed［21］。核苷酸插入和删除主要由核酸外切酶和末端脱氧核苷酸转移酶（terminal deoxynucleotidyl transferase，TdT）完成［29］。核苷酸的插入与删除发生在V（D）J的初始重排过程，理论上认为插入与删除是“随机的”，特征性插入与删除与胸腺的耐受选择和外周适应性应答相关。ZVYAGIN等［15］和RUBELT等［16］的研究结果提示TCRβ链CDR3受体库中核苷酸的剪切和插入受遗传因素影响。本实验进一步提示核苷酸的插入和删除前后5年的动态变化受遗传因素调控，而在功能性CDR3受体库中，同卵、异卵和非双胞胎前后5年的动态变化一致，提示外周T细胞受体库中的环境因素可能削弱初始T细胞受体库中的差异。尽管造成假基因CDR3受体库中插入与删除差异的机制没有阐明，但以同卵和异卵双胞胎为研究对象，分析突出的CDR3受体库的动态变化，特别是假基因CDR3序列，可为进一步的研究提供基础和手段。

（4）同卵、异卵和非双胞胎TCRβ链功能性CDR3受体库AA取用以及AA长度前后5年分析发现，同卵、异卵和非双胞胎前后5年差异随机分布，进一步提示了遗传因素与TCRβ链功能性CDR3受体库的AA取用及CDR3区AA的长度分布的关系，且课题组关于BALB/c小鼠的研究也显示出AA取用和长度分布没有随时间变化发生显著改变［30-31］。

（5）同卵、异卵和非双胞胎TCRβCDR3受体库Overlap前后5年分析发现，在TCRβ链假基因CDR3和TCRβ链功能性CDR3的全部氨基酸序列中，个体内前后5年的Overlap大于同卵、异卵和非双胞胎前后5年的Overlap，同卵、异卵和非双胞胎前后5年的Overlap无统计学差异。无论是假基因CDR3序列还是功能性CDR3序列，重叠序列的形成均与核苷酸的剪切、插入及TdT 3个因素有关，虽然假基因CDR3受体库中核苷酸剪切、插入的平均数目和遗传因素有一定相关性，但本实验的结果提示，在CDR3受体库中，不同个体之间剪切和插入的碱基可能是随机的，因此同卵、异卵和非双胞胎之间Overlap序列的数目无显著差异。经回访，双胞胎A、B、c彼此之间5年期间生活环境在同一城市。理论上，两个TCR受体库相同的人接触相同环境抗原，其TCR应答也可能存在差异［25］。同卵、异卵和非双胞胎前后5年的Overlap均提示Overlap与遗传因素相关性不大，而个体外在的环境因素可能是影响特异CDR3克隆增殖的主要因素。

本实验在ZVYAGIN等［15］和RUBELT等［16］探讨同卵双胞胎外周T细胞CDR3组库同质性的基础上，采用HTS对3对双胞胎前后5年外周血总T细胞TCRβ链CDR3受体库进行对比分析，获得了遗传因素对V（D）J重排偏向性影响的部分基础数据，特别是首次在双胞胎中进行了假基因家族CDR3受体库的动态对比分析。目前只有少数研究者在利用双胞胎的基因一致性探讨遗传因素对V（D）J重排的影响效应。在人体内，目前无法开展明确的机制研究（很难获得双胞胎的胸腺样本），在外周血的T细胞受体库研究中，存在个体经历的环境应答对遗传因素所造成影响的“稀释”性，探讨V（D）J重排和遗传影响相关性并未获得突破进展。通过本实验的初步探讨，为深入探讨遗传因素对TCR初始重排、耐受选择及外周适应性应答的效应和机制研究提供基础数据和新的方法。