脉冲电磁场对模拟高原环境下大鼠骨折愈合的影响

柏 鑫，樊 佳，侯雪峰，高玉海，吴思敏，任 莉，陈克明

骨折愈合是一个复杂的生物学修复过程，骨折愈合程度和时间受年龄、基础疾病、受伤程度、骨折部位、骨折类型及治疗方法等因素影响[1]，常需手术治疗，且延迟愈合、骨不连是术后常见并发症。研究发现，高原地区骨折愈合时间较平原地区延长，且骨折延迟愈合、骨不连发生率高于平原地区[2]，原因可能与高原地区氧分压低致缺氧、大气压低、气候干燥寒冷等多种因素对骨折愈合产生负面影响有关[3]。1974年Basset首次应用脉冲电磁场(PEMFs)治疗骨不连取得较满意效果[4]，PEMFs以无创伤、无接触、安全性高、疗效显著等优点被广泛应用于临床新鲜舟骨骨折、胫骨骨折延迟愈合等的治疗[5]。本实验以大鼠为研究对象，采用股骨横断骨折加克氏针髓内固定法建立动物模型，通过观察动物生活习性、影像学、生物力学等评判电磁场干预对高原环境下骨折愈合的影响。

1 材料与方法

1.1实验试剂 水合氯醛(天津大茂化学试剂公司，中国)、注射用青霉素(山东鲁抗医药股份有限公司，中国)、碘伏皮肤消毒液(上海利康消毒高科技有限公司，中国)、0.9%氯化钠注射液(四川科伦药业股份有限公司，中国)。

1.2实验仪器 电磁场治疗仪(本实验室自行研制，专利号：ZL201120528586.0)，DYC-3070型模拟高原低压低氧动物实验舱群(贵州风雷航空军械有限责任公司)，AG-X系列台式电子万能试验机(岛津公司，日本)，High Resolutionin-vivo X-ray Microtomograph(布鲁克科技有限公司，德国)，X线照片机(HOLOGIC公司，美国)，-20℃低温冰箱(三洋公司，日本)，1.2 mm钛合金克氏针(张家港市华阳医疗器械厂，中国)，骨科钻(上海紫霭医疗器械有限公司，中国)，可吸收缝合线(上海浦东金环医疗用品股份有限公司，中国)；圆锯，弯剪若干，手术刀，止血钳若干，3-0可吸收缝合线等相关手术器械。

1.3动物分组与处理 36只6～8周龄、体质量(220±10)g的雄性Wistar大鼠，购自兰州大学实验动物中心，许可证号：SCXK(甘)2018-0002。36只大鼠在本院SPF级动物实验中心适应性饲养1周后按随机数字表法分为平原对照组、高原对照组、高原电磁场治疗组，每组12只。

1.4造模方法 将大鼠禁食24 h后经10%水合氯醛(0．3 ml/100 g)腹腔注射麻醉，麻醉成功后将大鼠右下肢剃毛，局部皮肤碘伏消毒，铺无菌洞巾。沿右侧股骨切开皮肤，钝性分离肌肉并充分暴露股骨，使用直径0.8 mm克氏针垂直于股骨平行钻孔，间距约1 cm，使用圆锯垂直锯断股骨，切割同时使用生理盐水冲洗，防止过热损伤相应组织，将可吸收缝合线依次穿过断端0.8 mm孔洞备用，使用1.2 mm克氏针固定股骨，确认固定牢靠后将可吸收缝合线打结，保证骨折断端稳定性。逐层缝合伤口，术后连续3 d肌内注射青霉素预防感染。术后行X线检查，确认骨折类型为股骨中段横断骨折或短斜形骨折，骨折断裂间隙≤0.5 mm，骨折对位良好、无移位，即为造模成功[6]。

1.5干预措施 等待大鼠麻醉苏醒后将高原对照组及高原电磁场治疗组大鼠分别放入低压氧舱，以20 m/min的速度上升至海拔5000 m高度[7]，平原对照组大鼠饲养于本院SPF级动物实验中心(海拔1400 m)，高原电磁场治疗组大鼠采用50 Hz、0.6 mT、50%占空比的PEMFs处理，90 min/d[8]，其余2组大鼠做相同处理，但设备不通电。共干预8周，干预期间大鼠自由进食、摄水。

1.6观察项目与方法

1.6.1动物生活习性、体质量及脏器系数：实验期间密切观察大鼠生理反应和生活习性的变化，注意皮毛色泽、手术伤口是否发生感染、可吸收缝合线是否脱落及是否出现健肢代偿。每2周称量大鼠体质量1次，开始实验8周后采取颈椎脱臼法处死大鼠，立即取出心脏、肝脏、脾脏、肺及肾脏并称重，计算各脏器与体质量的比值即为脏器系数[9]。

1.6.2X线骨痂评分：每2周对大鼠行X线检查，扫描时先麻醉大鼠，后俯卧位拍摄每只大鼠。通过X线片观察各组大鼠骨痂生长情况，并根据X线骨痂评分标准请2名骨科医师及1名影像学医师评定大鼠骨痂生长情况。骨折断端未见骨痂为Ⅰ级；骨折断端边缘模糊，少见骨痂为Ⅱ级；断端边缘进一步模糊，骨痂量增多但尚未填满骨折缺损部位为Ⅲ级；断端边缘已完全消失，骨折缺损部位被骨痂填满为Ⅳ级。Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ级分别记为0、1、2、3分。

1.6.3生物力学指标：开始实验8周后，各组随机取6只大鼠，颈椎脱臼法处死，迅速分离术侧股骨，剔除软组织，拔出髓内钉，迅速用生理盐水浸泡纱布包裹保存于-20℃冰箱中待用，检测时样本室温下自然晾干后置于AG-IS生物力学万能试验机上行三点弯曲试验，支点跨距17 mm，中点为加压点，加载速度为2 mm/min，计算机记录载荷-位移曲线，得出弹性模量和最大载荷骨生物力学指标值[10]。

1.6.4显微CT扫描结果：开始实验4、8周后随机从各组取3只大鼠，过量麻醉处死，取出术侧股骨，剔除软组织，拔出髓内钉后用4%多聚甲醛固定后室温保存。使用SkyScan1276显微CT扫描仪，源电压85 V，源电流200 μA，中度分辨率，感兴趣区域为以骨折线为中心的前后4 mm区域。使用CTvox软件对股骨建模，使用NRecon软件进行三维重建。

2 结果

2.1大鼠一般情况 实验期间3组大鼠体质量比较差异无统计学意义(P>0.05)，见表1。开始实验8周后3组大鼠脏器系数比较差异无统计学意义(P>0.05)，见表2。实验期间大鼠饮食饮水无明显变化，皮毛色泽正常、手术伤口无感染、缝合线自然脱落，未出现健肢代偿，饲养于模拟高原环境下大鼠活动稍减弱。

表1 3组大鼠实验期间体质量变化情况

表2 3组大鼠开始实验8周后脏器系数比较情况

2.2X线骨痂评分及X线检查结果比较 实验期间，平原对照组及高原电磁场治疗组骨折X线骨痂评分均高于高原对照组(P<0．05)，平原对照组与高原电磁场治疗组相比差异无统计学意义(P>0.05)。见表3。

表3 3组大鼠实验期间X线骨痂评分情况分)

造模后及开始实验2、4、6、8周后3组大鼠股骨X线检查情况见图1。开始实验2周后3组均有骨痂形成，但高原对照组骨痂量相对较少。开始实验4周后平原对照组及高原电磁场治疗组骨折周围可见梭形骨痂影，骨折线模糊，而高原对照组虽有骨痂形成但骨折线仍清晰可见。开始实验6周后平原对照组及高原电磁场治疗组骨折周围梭形影逐渐规则、致密，而高原对照组仍可见模糊骨折线。开始实验8周后平原对照组及高原电磁场治疗组股骨应力轴线以外的骨痂较前减少，说明此时骨折已进入骨痂塑形期，而高原对照组骨折断端仍有不规则骨痂，由此可见高原对照组骨折愈合较其他2组缓慢。

2.3生物力学指标比较 开始实验8周后，高原对照组股骨弹性模量、最大载荷均低于平原对照组与高原电磁场治疗组(P<0．05)，平原对照组与高原电磁场治疗组比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表4。

表4 3组大鼠实验8周后股骨生物力学指标比较

2.4显微CT扫描结果比较 开始实验4周后显微CT扫描感兴趣区骨痂平面横切图(图2)、立体重建图(图3)及立体纵切图(图4)可见，平原对照组与高原电磁场治疗组骨折断端出现大量骨痂包裹，骨折断端边缘模糊，缺损区域几乎被骨痂填满。高原对照组骨折断端生成的骨痂较少，骨折断端边缘仍清晰可见，缺损区域较大且仅有少量骨痂填充。开始实验8周后显微CT扫描感兴趣区骨痂平面横切图(图5)、立体重建图(图6)及立体纵切图(图7)可见平原对照组及高原电磁场治疗组股骨应力轴线以外的骨痂较开始实验4周后减少，骨小梁排列规则、致密，骨折部位形成骨性连接，而高原对照组骨折周围仍可见梭形骨痂，骨折线仍可见。进一步证明高原对照组骨折愈合较其他2组缓慢。

图2 3组大鼠开始实验4周后显微CT扫描平面横切图

图3 3组大鼠开始实验4周后显微CT扫描立体重建图

图4 3组大鼠开始实验4周后显微CT扫描立体纵切图

图5 3组大鼠开始实验8周后显微CT扫描平面横切图

图6 3组大鼠开始实验8周后显微CT扫描立体重建图

图7 3组大鼠开始实验8周后显微CT扫描立体纵切图

3 讨论

骨折是临床骨科常见疾病，骨折延迟愈合、不愈合是骨折术后常见并发症，而在高海拔、低气压、低氧、低温环境下骨延迟愈合、骨不连的发生率均高于平原地区，严重影响患者的生活质量。近年来随着高原医学的发展，高原低压缺氧环境对骨组织的影响逐渐受到人们的关注[11]。

本实验通过观察大鼠一般情况、测量体质量及计算脏器系数来比较不同饲养环境对大鼠身体状况的影响，结果显示整个实验过程中饲养于模拟高原环境下大鼠活动稍减弱，3组大鼠体质量比较差异无统计学意义，脏器系数比较差异无统计学意义，3组大鼠一般情况良好，精神状态佳，提示本实验所用电磁场设备具有较好的安全性。通过X线骨痂评分及图像比较骨痂生长情况及骨折愈合情况。X线骨痂评分结果显示，实验期间平原对照组及高原电磁场治疗组X线骨痂评分均高于高原对照组，差异有统计学意义，而平原对照组与高原电磁场治疗组X线骨痂评分比较差异无统计学意义。X线图像比对显示，实验期间平原对照组及高原电磁场治疗组愈合情况较接近，而高原对照组骨痂形成缓慢且数量相对较少，骨折愈合较其他2组缓慢，同时显微CT扫描结果进一步证实了上述结论。通过股骨三点弯曲试验来检测骨生物力学性能，骨生物力学参数可以直接反映出骨的抗骨折能力，骨最大载荷可以客观反映出骨整体的抗骨折能力，弹性模量可客观反映骨自身的相对韧性[12]。本实验结果显示，开始实验8周后平原对照组及高原电磁场治疗组弹性模量及最大载荷均高于高原对照组，差异有统计学意义，而平原对照组与高原电磁场治疗组弹性模量及最大载荷比较差异无统计学意义。提示电磁场治疗提高了高原环境下骨折骨组织的生物力学性能，使高原环境下骨折骨组织的生物力学性能与平原低海拔地区相近。

综上，PEMFs干预可以有效加速模拟高原环境下股骨骨折大鼠骨折愈合，促进骨痂形成，缩短骨折愈合时间，提高股骨强度,使骨折愈合情况与平原低海拔地区相近，但具体作用机制仍需进一步研究。