松脂醇二葡萄糖苷促进体外培养成骨细胞骨形成的作用研究

吴思敏，孙 薇，高玉海，任 莉，陈克明

[作者单位] 730050 兰州，解放军联勤保障部队第九四〇医院骨科研究所(吴思敏、高玉海、任莉、陈克明)；610083 成都，西部战区总医院药剂科(孙薇)

骨质疏松症是一种严重的公共健康威胁，其患病率预计在未来几十年内急剧上升，主要威胁绝经后妇女和老年人[1-2]。此外，全球范围内一项大型研究报道，普遍或偶发骨质疏松性骨折的年度总成本比率超过了许多其他严重慢性病[3-4]。松脂醇二葡萄糖苷是杜仲的主要有效成分[5]。杜仲是杜仲科植物杜仲的干燥树皮，具有补肝肾、强筋骨、安胎之功效[6]。现代药理学研究表明，杜仲具有增加骨密度、改善骨小梁微结构、抑制骨量减少和骨强度下降等作用，因此是很多治疗骨质疏松症方剂的常用药[7]。基于此点，我们提出可将松脂醇二葡萄糖苷运用于骨质疏松症的治疗。本实验也表明适当浓度的松脂醇二葡萄糖苷对成骨细胞的骨形成确有促进作用，且进一步表明其也可能具有抗骨质疏松作用，但到目前为止关于松脂醇二葡萄糖苷抗骨质疏松作用的研究还很少。现将本实验内容报告如下。

1 材料与方法

1.1实验动物 取出生3 d内的SPF级Wistar大鼠乳鼠，由解放军联勤保障部队第九四〇医院动物实验所提供(合格证号:SCXK甘2015-0002)。

1.2试剂和耗材 松脂醇二葡萄糖苷(厦门慧嘉生物科技有限公司，批号：DST180313-013，纯度98.85%)，二甲基亚砜(DMSO)制备松脂醇储备液(浓度为0.1 mol/L)储存在-20℃条件下，培养液中DMSO的最终浓度<5‰。α-MEM培养基(Gibco公司，货号：2090463)；胎牛血清(Biological Industries公司，货号：04-001-1A)；青链霉素混合液(Solarbio公司，货号：P1400)；胰蛋白酶-EDTA溶液(Solarbio公司，货号：T1300)；胶原酶Ⅱ(Solarbio公司，货号：C8150)；高效RIPA裂解液(Solarbio公司，货号：R0010)；地塞米松(Sigma公司，货号：D1756)；L-抗坏血酸(Sigma公司，货号：A7631)；β-甘油磷酸(上海阿拉丁生化科技股份有限公司，货号：D106347)；ECL Plus超敏发光液(Solarbio公司，货号：PE0010)；RNAiso Plus[宝生物工程(大连)有限公司，货号：9109]；碱性磷酸酶(ALP)检测试剂盒(南京建成生物工程研究所，货号：A059-1-1)；PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser[宝生物工程(大连)有限公司，货号：RR047A]；TB Green® Premix Ex TaqTMⅡ[宝生物工程(大连)有限公司，货号：RR820A]；BCA蛋白浓度测定试剂盒(Solarbio公司，货号：PC0020)；十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳试剂盒(Solarbio公司，货号：P1200)；100、60 mm培养皿(Coring Costar公司，货号：430167、430196)；35 mm培养皿(Thermo公司，货号：150460)；6孔板(上海科进生物技术有限公司，货号：10006)；96孔板(上海科进生物技术有限公司，货号：10096)。CO2培养箱(Thermo Revco公司，型号：Forma371)；倒置相差显微镜(Olympus公司，型号：IX71)；台式高速离心机(Heraeus公司，型号：Primo R)；高速冷冻离心机(湘仪离心机仪器有限公司，H1650R)；低速离心机(北京医用离心机厂，型号：LD5-2A)；紫外分光光度计(惠普公司，型号：G1115A)；酶标仪(Bio Tek公司，型号：EPOCH)。

1.3实验方法

1.3.1细胞培养和浓度筛选：①细胞培养[8]：取出生3 d内的SPF级Wistar大鼠乳鼠5只,置于75%乙醇中浸没消毒处死。在无菌工作台上分离出颅骨，用磷酸盐缓冲溶液(PBS)漂洗，去除多余的结缔组织。将颅骨剪碎，加入0.25%的胰蛋白酶，37℃水浴中轻轻震荡消化15 min，重复2次；弃胰蛋白酶消化液，再加入0.1%Ⅱ型胶原酶，置于37℃水浴中震荡消化，重复4～5次。后将胶原酶上清消化液合并，用200目细胞筛过滤，收集滤液，室温下1500 r/min离心10 min，弃去上清液，收集沉淀，然后用含10%胎牛血清的α-MEM培养液重悬细胞沉淀，得到单细胞悬液。将细胞悬液调整至合适的密度转入100 mm细胞培养皿中，置于37℃、5% CO2培养箱中培养，第2天更换培养液，之后每3天更换培养液1次，待细胞增殖融合至90%后，用0.25%胰蛋白酶消化传代，用于后续实验。②浓度筛选：将培养好的成骨细胞以2400/孔的密度接种于96孔板中，每孔加培养液100 μl于37℃、5% CO2培养箱中培养。当细胞达到融合状态(一般为1 d后),弃去培养基，配置新的培养液，再将之前已制备好的松脂醇二葡萄糖苷储备液按浓度由高到低依次添加培养液，使得细胞培养液中松脂醇二葡萄糖苷终浓度依次为0、1×10-5、1×10-6、1×10-7、1×10-8、1×10-9mol/L(每个浓度5孔)，再于培养箱中培养3 d测定ALP活性。设置空白组及实验组，空白组中加入双蒸水，实验组为加药组。向上述各组中加入1︰1的缓冲液与基质液，轻轻震荡摇匀，置于37℃、5% CO2细胞培养箱中孵育15 min；向孵育好的各组细胞中加入显色液并即刻混匀置于酶标仪上，在520 nm波长处测量吸光度。

1.3.2钙化结节染色：将刚提取分离的成骨细胞以合适的密度接种于6孔板中，3 d更换培养基1次。待成骨细胞融合>90%时进行加药处理，将培养基更换为含5%胎牛血清的α-MEM培养基，再加入合适浓度诱导剂β-甘油磷酸、L-抗坏血酸和地塞米松，诱导成骨细胞分化。显微镜下观察细胞呈沙状亮点聚集即为钙化结节。弃去培养基，PBS液漂洗细胞3次；加入多聚甲醛固定液固定10 min，吸净固定液后再用PBS液漂洗；加入适量茜素红S染色液，37℃环境下避光孵育60 min，染色时间可根据肉眼观察染色状态进行调整；轻轻晃动观察，待皿底出现深红色斑点时弃去染色液，PBS液漂洗至无多余染色液，显微镜下观察并拍照保存染色结果。

1.3.3基因表达检测：①收集细胞：将培养好的细胞按照适当密度接种至60 mm培养皿中，随机分为空白组和实验组，培养24 h后弃去培养液，预冷PBS液洗涤3次，每皿加入适量的RNAiso Plus，冰浴裂解10 min后将细胞吹下收集在1.5 ml离心管中放于-80℃冰箱中备用。②RT-PCR分析：向上述融化的样本中加入适量的三氯甲烷，12 000×g离心15 min。取上清再加入0.5倍体积的异丙醇，静置30 min后12 000×g离心15 min。弃上清，保留离心管底部的白色沉淀，加入1 ml DEPC水配置的75%乙醇清洗沉淀2次，每次12 000×g离心15 min。弃上清，待离心管中的液体挥发完全后加入15～50 μl DEPC水溶解沉淀。按照TaKaRa Prime ScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser试剂盒说明进行实验。最终得到的cDNA样品放于-80℃冰箱中备用。再按照TaKaRa Prime Ex TaqTMⅡ试剂盒说明操作。将混合好的PCR反应液按分组加入八连管中置于qPCR仪中按说明书设置反应条件。GAPDH作内参基因校正结果。引物序列见表1。

表1 qPCR引物序列表

1.3.4蛋白表达检测：将培养好经过加药处理的细胞从培养箱中取出，弃去上清液，PBS液漂洗3次，加入适量的高效RIPA裂解液在摇床上冰浴裂解。裂解后13 000×g离心25 min，收集蛋白上清。应用BCA蛋白浓度测定试剂盒检测样品中的蛋白浓度，完成蛋白定量检测后加热变性。应用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶制备试剂盒配置分离胶和浓缩胶，待其完全凝固后上样，通过电泳分离蛋白，然后按照相应的分子量转移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上；转移到含5%脱脂奶粉的封闭液中室温封闭2 h，按照抗体说明在相应的一抗稀释液中4℃孵育过夜；次日将PVDF膜复温1 h，后用TBST洗涤5次，每次8 min。二抗1︰10 000稀释，再按1︰10比例加入含5%脱脂奶粉的封闭液，室温下摇床孵育2 h，后用TBST洗涤4次，每次10 min。用ECL Plus超敏发光液在暗室中进行显色。利用Image J软件扫描胶片，Adobe Photoshop CS5处理条带。

2 结果

2.1对成骨细胞ALP活性的影响 松脂醇二葡萄糖苷处理成骨细胞的最佳浓度为1×10-6mol/L(P<0.01)。见图1。

2.2对钙化结节的影响 浓度为1×10-6mol/L的松脂醇二葡萄糖苷处理成骨细胞后,其钙化结节形成程度明显高于空白组。见图2。

图2 松脂醇二葡萄糖苷对成骨细胞钙化结节的影响

2.3松脂醇二葡萄糖苷对成骨细胞成骨相关基因表达的影响 松脂醇二葡萄糖苷介导的BMP-2、RUNX-2和OSX基因表达量均显著增加(P<0.05或P<0.01)，见图3。

图3 松脂醇二葡萄糖苷对成骨细胞成骨相关基因表达量的影响

2.4松脂醇二葡萄糖苷对成骨细胞成骨相关蛋白表达的影响 松脂醇二葡萄糖苷处理后成骨细胞成骨相关蛋白BMP-2、RUNX-2和OSX表达量均有所增加。见图4。

图4 松脂醇二葡萄糖苷对成骨细胞成骨相关蛋白表达的影响

3 讨论

骨质疏松症是一种与衰老相关的疾病，困扰着全球数百万人[9]。随着人们的寿命越来越长，与寿命延长相关的是各种低创伤性骨折发生率升高和其后果[10]。近年最被大众所接受的骨质疏松症治疗药物为双膦酸盐，但双膦酸盐口服吸收性非常差[11]。近年人们对中草药在骨质疏松症治疗方面的功效产生了浓厚的兴趣，中草药成本低、易获取、毒副作用小，或将成为治疗骨质疏松症的重要方法。据报道杜仲能够调节骨代谢，而松脂醇二葡萄糖苷是杜仲的主要有效成分，体外细胞实验表明松脂醇二葡萄糖苷可促进成骨细胞的成骨性分化，因而有成为抗骨质疏松新药的潜力[12]。

ALP活性是成骨细胞早期成熟和分化的标志，可反映骨形成状况，其表达随着细胞分化的成熟而增强。若一种药物可以增强成骨细胞ALP活性，说明其具有促进骨形成的作用[13]。本实验先以ALP活性为指标检测成骨细胞活性，结果表明，1×10-6mol/L松脂醇二葡萄糖苷处理后ALP活性最高。钙化结节是成骨细胞矿化机制形成的标志。1×10-6mol/L松脂醇二葡萄糖苷处理成骨细胞后，钙化结节形成显著增多,明确了松脂醇二葡萄糖苷会影响成骨细胞骨形成。同时，本实验也检测了松脂醇二葡萄糖苷促进体外培养成骨细胞骨形成过程中相关蛋白、基因的表达水平，结果显示1×10-6mol/L松脂醇二葡萄糖苷处理可使成骨细胞成骨相关蛋白基因BMP-2、RUNX-2与OSX表达水平显著升高。众所周知，OSX位于RUNX-2的下游，其蛋白表达量会根据RUNX-2的变化而变化。在本实验中，经松脂醇二葡萄糖苷处理后，成骨细胞RUNX-2与OSX的变化确实一致。所以，松脂醇二葡萄糖苷可促进成骨细胞的增殖和分化。

综上,1×10-6mol/L松脂醇二葡萄糖苷可促进体外培养大鼠乳鼠颅骨成骨细胞骨形成，增加钙化结节面积，并可升高成骨相关蛋白基因BMP-2、RUNX-2及OSX表达，但具体机制还需进一步研究。