木香烃内酯对体外培养大鼠骨髓间充质干细胞成骨性分化的影响

任 莉，李慧敏，高玉海，吴思敏，陈克明

由于人口结构的变化和预期寿命的延长，骨疾病尤其是骨质疏松症变得越来越普遍。2016年中国60岁以上的老年人骨质疏松症患病率达36%，说明骨质疏松症已成为重要的公共卫生问题[1]。骨髓间充质干细胞(BMSCs)具有多向分化潜能，能促进骨、软骨、肌肉、韧带、肌腱、脂肪及基质等间充质组织的再生[2]。因此，如能有效促进BMSCs成骨性分化就有可能增加成骨细胞的数量和增强其活性，从而加速骨骼形成。而药物可通过上述过程促进骨吸收，达到减缓骨质疏松的效果。木香烃内酯是从传统中药木香中提取的一种倍半萜内酯，研究发现其具有抗炎、抗真菌、抗癌等多种生物活性[3]。本实验研究了木香烃内酯对大鼠BMSCs成骨性分化的影响，现报告如下。

1 材料与方法

1.1实验材料 木香烃内酯购自宝鸡辰光有限公司，纯度>98%。SPF级SD大鼠，甘肃省中医学院动物实验中心提供，合格证号SCXK(甘)2009-0006-152。

1.2实验方法

1.2.1原代大鼠BMSCs分离培养：取80～120 g SD大鼠4只，原代大鼠BMSCs分离培养方法参考文献[4-5]。脱颈处死大鼠后75%乙醇浸泡15 min，无菌条件下剥离出股骨和胫骨，剪去两端骨骺，并用含10%胎牛血清的L-DMEM培养基完全冲出骨髓，直至骨髓腔变白，合并冲出液，反复吹打，使细胞团块尽量打散。在37℃、5% CO2饱和湿度条件下培养3 d，弃培养液，用磷酸盐缓冲溶液(PBS)洗涤2遍，换新鲜培养液继续培养。此后每3天换液1次，待细胞铺满培养皿底80%～90%时行成骨性诱导培养,诱导条件为10-7mol/L地塞米松、10 mmol/L β-甘油磷酸和50 mg/L L-抗坏血酸。

1.2.2成骨性诱导培养：原代细胞首次换液后用10-6mol/L木香烃内酯培养(木香烃内酯组)，对照组加入等体积的二甲基亚砜(DMSO)木香烃内酯载体溶液，待细胞生长融合为80%～90%时行成骨性诱导培养，成骨诱导培养不同时间点检测成骨性分化相关指标。

1.2.3碱性磷酸酶(ALP)活性测定：将传至第3代的大鼠BMSCs接种于12孔板中，然后使用10-5～10-8mol/L木香烃内酯对大鼠BMSCs进行干预(每种浓度6孔)，同时设置对照组，待细胞生长融合为80%～90%时，加入成骨诱导剂行成骨性诱导培养。通常9 d后ALP活性达峰值，通过比较不同浓度木香烃内酯干预后ALP活性来确定木香烃内酯的最佳作用浓度。

1.2.4茜素红染色：原代细胞以每孔2 ml接种于6孔板中，培养液中含10%胎牛血清。于成骨性诱导培养第12天，采用茜素红染色法行钙化结节组织化学染色。PBS液洗涤后，10%甲醛固定10 min。加入茜素红染色剂，37℃孵育30 min，观察钙化结节的形成情况。

1.2.5BMP-2、RUNX-2和CollagenⅠ基因表达：BMP-2、RUNX-2、CollagenⅠ和GAPDH引物由上海百赛公司设计并合成。于木香烃内酯干预24 h后，采用Trizol一步法提取总RNA，逆转录体系、PCR扩增体系及反应条件均参照说明书设定。RT-PCR数据采用ΔΔCt处理，实验使用GAPDH为对照基因对数据进行处理，采用2-ΔΔCt表示结果，方法见文献[6]。引物序列见表1。

表1 BMP-2、RUNX-2、CollagenⅠ和GAPDH引物序列

1.2.6BMP-2、RUNX-2和CollagenⅠ蛋白表达：将原代大鼠BMSCs接种培养,首次换液后用木香烃内酯10-6mol/L培养(木香烃内酯组)，对照组加入等体积DMSO木香烃内酯载体溶液，待细胞生长融合为80%～90%时加入成骨性诱导剂行成骨性诱导培养，48 h后采用Western blot法检测成骨活性相关蛋白表达。

2 结果

2.1BMSCs形态学观察 镜下观察，培养初期大鼠BMSCs以梭形为主(图1A，×10)，形成单细胞克隆(图1B，×4)，随着培养时间延长细胞体积增大(图1C，×10)，诱导培养9 d左右出现钙化结节(图1D，×10)。

图1 大鼠骨髓间充质干细胞形态学观察

2.2木香烃内酯对大鼠BMSCs的最佳作用浓度 对照组ALP活性为31 U/gprot，10-5～10-8mol/L木香烃内酯干预大鼠BMSCs 9 d后，ALP活性分别为26、41、37、33 U/gprot。因此10-6mol/L为木香烃内酯对大鼠BMSCs的最佳作用浓度，后续实验均采用此浓度。不同浓度木香烃内酯干预大鼠BMSCs 9 d后ALP活性见图2。

图2 不同浓度木香烃内酯干预大鼠骨髓间充质干细胞9 d后碱性磷酸酶活性变化情况

2.3茜素红染色结果 BMSCs经木香烃内酯诱导培养12 d后行茜素红染色，发现木香烃内酯组钙化结节数目多于对照组(P<0.01)。茜素红染色结果见图3，钙化结节阳性克隆统计结果见图4。

图4 大鼠骨髓间充质干细胞诱导培养12 d后钙化结节阳性克隆统计

图3 大鼠骨髓间充质干细胞诱导培养12 d后茜素红染色

2.4木香烃内酯对BMP-2、RUNX-2和CollagenⅠ基因表达的影响 木香烃内酯组BMP-2、RUNX-2及CollagenⅠ mRNA表达水平均高于对照组(P<0.05或P<0.01)，见图5。

图5 木香烃内酯干预大鼠骨髓间充质干细胞对BMP-2、RUNX-2和CollagenⅠ基因表达的影响

2.5木香烃内酯对BMP-2、RUNX-2和CollagenⅠ蛋白表达的影响 木香烃内酯干预大鼠BMSCs 48 h后采用Western blot法检测成骨活性相关蛋白表达情况，木香烃内酯组BMP-2、RUNX-2和CollagenⅠ蛋白表达水平高于对照组。见图6。

图6 木香烃内酯干预大鼠骨髓间充质干细胞对BMP-2、RUNX-2和CollagenⅠ蛋白表达的影响

3 讨论

研究发现，骨质疏松症主要是由于骨代谢过程中骨形成和骨吸收失衡所致，BMSCs向成骨细胞分化的能力降低，进而导致骨形成减少[7]，而BMSCs具有多向分化潜能，可在不同微环境下定向诱导分化为成骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞和神经细胞等，具有良好的应用前景[8-10]。另有研究报道，云木香具有抗炎、抗肿瘤、降血糖、抗真菌等多种生物活性[3]。抗肿瘤是木香烃内酯的主要药理活性[11]。本研究以大鼠BMSCs为对象，用木香烃内酯进行干预，研究木香烃内酯对大鼠BMSCs的影响。结果显示，10-6mol/L为木香烃内酯提高大鼠BMSCs成骨性分化的最佳作用浓度，而10-5mol/L的木香烃内酯可抑制ALP活性，说明木香烃内酯对BMSCs成骨性分化存在浓度依赖性。本实验还经检测ALP活性、钙化结节染色和成骨活性相关蛋白、基因表达，明确木香烃内酯对大鼠BMSCs成骨性分化的影响。

BMSCs在骨修复过程中发挥重要作用[12]。木香烃内酯是中药木香的主要有效成分，是一种倍半萜内酯类化合物。木香烃内酯分子结构中包含α-亚甲基-γ-内酯环，该结构能与含有巯基的酶及其功能性蛋白酶发生反应，进而干扰细胞的代谢过程，从而发挥多种药理活性[13]。但目前关于木香烃内酯影响BMSCs成骨性分化的报道还较少。ALP是成骨细胞前体成骨性分化的重要标志物[14]，因此本文从ALP活性水平筛选木香烃内酯的最佳作用浓度，结果显示不同浓度木香烃内酯作用BMSCs 9 d后，测定ALP活性发现，除10-5mol/L木香烃内酯对ALP活性产生抑制作用外，其余浓度(10-6、10-7、10-8mol/L)木香烃内酯干预大鼠BMSCs的ALP活性均高于对照组，且10-6mol/L木香烃内酯干预后的ALP活性最高。钙化结节染色发现，相较对照组，木香烃内酯组BMSCs茜素红染色钙化结节阳性克隆更加密集，颜色也更深。这些结果表明，木香烃内酯能促进大鼠BMSCs成骨性分化。木香烃内酯组BMP-2、RUNX-2和CollagenⅠ基因表达显著高于对照组；BMP-2、RUNX-2和CollagenⅠ蛋白是成骨细胞的标志蛋白，本实验检测BMP-2、RUNX-2和CollagenⅠ蛋白表达发现，木香烃内酯组BMP-2、RUNX-2和CollagenⅠ蛋白表达水平升高，说明木香烃内酯可促进大鼠BMSCs向成骨细胞分化。

综上，木香烃内酯能诱导大鼠BMSCs向成骨细胞分化，且浓度为10-6mol/L时诱导作用最强。