甲苯磺酸索拉非尼片微生物限度检查方法研究

张春华，刘绪平，邓维，章瑛

江西省药品检验检测研究院，国家药品监督管理局中成药质量评价重点实验室，江西省药品与医疗器械质量工程技术研究中心，江西 南昌 330029

甲苯磺酸索拉非尼片，商品名为多吉美（Nexavar）为多靶点抗肿瘤药，临床上主要用于不能手术的晚期肾细胞癌以及无法手术或远处转移的肝细胞癌。其对原发性肝癌治疗效果好，可延迟病灶进展、改善生存质量和健康水平，且降低不良影响的发生率［2-6］。最常见的不良反应为胃肠道反应和血小板降低及手足皮肤反应［7-10］，为预防患者用药时带来一些安全隐患，本研究根据《中国药典》2015 年版四部的要求对其进行了微生物限度计数方法研究，建立了甲苯磺酸索拉非尼片的微生物限度检查方法［1］，且检验效果良好。

1 实验仪器与材料

1.1 实验仪器

电子天平Quintix6101-1CN；生物安全柜13844'BSC赛默飞；细菌培养箱SPL-250；霉菌培养箱3758CN；集菌仪；恒温震荡器。

1.2 培养基

所用培养基适用性均符合《中国药典》2015 年版四部的要求，见表1。

表1 培养基信息

1.3 试验菌种

金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）CMCC（B）26003，铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa），CMCC（B）10104；大肠埃希菌（Escherichia coli），CMCC（B）44102；枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis），CMCC（B）63501；黑曲霉（Aspergillus niger），CMCC（F）98003；白色念珠菌（Candida albicans），CMCC（F）98001。菌种均来源于中国食品药品检定研究院。

1.4 样品

甲苯磺酸索拉非尼片，江西山香药业有限公司，规格：0.2 g，批号：180501。

2 方法

2.1 菌液的制备

取金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌分别接种于适量的TSB 中，经33 ℃培养24 h 后，取新鲜培养物1 mL，用pH 7.0氯化钠蛋白胨缓冲液10 倍稀释至10-3～10-7。

取黑曲霉接种至SDA 斜面上，经23 ℃培养1周后，取新鲜培养物用3 mL～5 mL 含0.05%吐温80 的0.9%无菌氧化钠溶液洗下黑曲霉孢子，吸取出孢子悬液1 mL，加上述稀释剂适量稀释，用标准比浊管比浊，其浊度与标准比浊管相当后，取1 mL 稀释后的孢子悬液，用上述稀释剂10 倍稀释至10-2～10-4。

取白色念珠菌接种于适量的SDA 中，经23 ℃培养3 d 后，取新鲜培养物1 mL，用pH 7.0 氯化钠蛋白胨缓冲液10 倍稀释至10-2～10-4。

上述试验菌株均为第2 代菌。

2.2 样品的制备

取本品10 g，放置无菌的锥形瓶中，加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100 mL，恒温振摇5 min，作为1∶10 供试液。

2.3 方法验证

2.3.1 预实验选用金黄色葡萄球菌（需氧菌）、白色念珠菌（真菌）作为敏感菌株进行预试验，结果详见表2 和表3。

表2 金黄色葡萄球菌预试验的结果

表3 白色念珠菌预试验的结果

上述结果表明，甲苯磺酸索拉非尼片对需氧菌具有抑制作用，而对霉菌和酵母菌没有抑制作用，根据预试验的结果，初步确定采用薄膜过滤法（1∶10的供试液1 mL，冲洗300 mL）进行需氧菌总数计数，采用平皿法（1∶10 的供试液）进行霉菌和酵母菌总数计数。

2.3.2 微生物计数方法的适用性试验适量的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液抽入滤器中，然后取上述制备好的1∶10 供试液1 mL，混匀，全部通过滤膜，再用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液300 mL冲洗，每次100 mL/筒，冲洗3 次，在最后一次冲洗液中加入试验菌（≤100 cfu），滤干，立即贴膜于预制好的TSA 平板上，作为需氧菌总数计数法检查。

取6 支试管，4 支试管分别加入上述制备好的1∶10 供试液9.9 mL 和2 支试管加入pH7.0 无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液9.9 mL，再加入适宜浓度的试验菌液0.1 mL，混匀，作为试验组和菌液对照组。分别取注入平皿，测定霉菌和酵母菌总数。

取上述制备好的1∶10 供试液和相应稀释液替代供试液同试验组操作，测定供试品对照组菌落数和菌液组菌落数。

需氧菌总数选用金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌（置33 ℃培养箱培养24 h～72 h）白色念珠菌和黑曲霉（置33 ℃培养箱培养24 h～120 h），霉菌和酵母菌总数选用白色念珠菌和黑曲霉（置23 ℃培养箱培养2 h～120 h），均需逐日观察结果。结果均符合要求，见表4。

表4 微生物计数方法适用性试验结果

回收比值=（供试品试验组菌落数－供试品对照组菌落数）÷菌液组菌落数

2.3.3 控制菌检查方法适用性试验 取上述制备好的1∶10 供试液10 mL 加入100 mL TSB 中，同时加入小于100 cfu 的大肠埃希菌液，混匀后，培养18 h 后，取培养物1 mL 接种至100 mL MACB 中，置42 ℃培养24 h 后，取MACB 增菌液划线接种于MACA平板上，置33 ℃培养72 h 后，取MACA 平板上菌落经纯化后的培养物，接种至含5 mL MUG 培养基的试管内，同时用未接种的MUG 培养基作本底对照。置33 ℃培养，于5 h、24 h 在366 nm 紫外线下观察，取稀释液10 mL 照上述方法操作，作为阴性对照组。

试验组的 MUG-I 呈现蓝白色荧光，观察后，沿管壁加入数滴靛基质试液，试验组的MUG-I 液面呈玫瑰红色，试验呈阳性，检出大肠埃希菌；阴性对照组的 MUG-I 未呈荧光，试验呈阴性，未检出大肠埃希菌。

3 讨论

在进行供试品计数方法验证时，根据样品的成分和性质判断，选择对供试品可能敏感的菌株进行试验，从预实验的结果建立样品的微生物计数方法。综合上述研究结果显示，甲苯磺酸索拉非尼片具有一定的抑菌作用，尤其是对于细菌抑菌性较强，若采取平皿法，会导致试验结果的回收效果不理想。为了研究微生物限度检查方法的成效，按照药典要求对甲苯磺酸索拉非尼片微生物限度检查进行研究，所实验的各试验菌其回收比值符合药典规定，试验方法可用于甲苯磺酸索拉非尼片的微生物限度检查。