高效液相色谱法测定复方氨酚美沙糖浆中抑菌剂含量

蔡锦雄，庞赛，梁爱仙，刘敏，李玉兰，王铁杰

深圳市药品检验研究院，深圳药品质量标准研究重点实验室，广东 深圳 518057

复方氨酚美沙糖浆为复方抗感冒药，临床用于普通感冒或流行性感冒引起的发热、头痛、四肢酸痛、打喷嚏、流鼻涕和咳嗽等症状。现行标准收载于《国家药品标准》化学药品地方标准上升国家标准（第三册）［1］，但未对抑菌剂的含量进行规定。在含糖量较低的糖浆剂中，通常需要加入抑菌剂，防止出现霉败现象，在本制剂中，添加的抑菌剂为苯甲酸钠和羟苯甲酯。糖浆剂中的抑菌剂用量不足时，可能导致制剂霉败；而过量时，可能产生毒性［2-13］。因此，需要关注糖浆剂中抑菌剂的用量问题。本研究参考文献［14-15］方法，建立高效液相色谱法（HPLC）测定复方氨酚美沙糖浆中苯甲酸钠和羟苯甲酯的含量。

1 仪器与材料

1.1 仪器

Waters e2695 型高效液相色谱仪，包括二极管阵列检测器、Empower 3色谱工作站（美国Waters公司）；XS205DU 电子天平（十万分之一，瑞士梅特勒公司）；Milli-Q Reference 纯水器（德国默克公司）。

1.2 材料

苯甲酸钠对照品（批号：100047-201507，含量：99.7%）、羟苯甲酯对照品（批号：100047-201507，含量：99.9%）均购自中国食品药品检定研究院；乙腈、三乙胺为色谱纯，磷酸二氢钾、己烷磺酸钠、磷酸为分析纯；水为超纯水；复方氨酚美沙糖浆（国内某公司，批号19111712、19111812、19111912，规格：120 mL/瓶，苯甲酸钠含量：1 mg/mL，羟苯甲酯含量：1 mg/mL）。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Agilent Zorbax SB C18 色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；以磷酸盐缓冲液（称取磷酸二氢钾6.8 g、己烷磺酸钠0.565 g，加三乙胺2 mL，加水1 000 mL 溶解，用磷酸调节pH 值至2.3）为流动相A，以乙腈为流动相B，按表1 进行梯度洗脱；流速为1.0 mL/min；柱温为30 ℃；检测波长为215 nm。

表1 梯度洗脱程序

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液取苯甲酸钠对照品和羟苯甲酯对照品各适量，精密称定，加溶剂（流动相A-流动相B（85∶15）溶解并定量稀释制成每1 mL 含苯甲酸钠0.1 mg 和羟苯甲酯0.1 mg 的混合溶液，摇匀，弃去初滤液2 mL，取续滤液。

2.2.2 供试品溶液用内容量移液管精密量取本品1 mL，置10 mL 量瓶中，加溶剂稀释至刻度，摇匀，弃去初滤液2 mL，取续滤液。

2.2.3 阴性样品溶液参照复方氨酚美沙糖浆配方比例和制备工艺，制备缺2 种防腐剂的阴性样品，并按“2.2.2”项下方法制备阴性样品溶液。

2.3 系统适用性试验

分别取对照品溶液、供试品溶液和阴性样品溶液，按“2.1”项下色谱条件进行测定，记录色谱图，分别见图1。图谱显示，对照品溶液和供试品溶液中，各组分与相邻色谱峰分离度均大于3.3，理论板数均大于50 000，表明该方法系统适用性良好。阴性样品溶液在2 种抑菌剂相应色谱峰位置，均未见色谱峰，表明阴性样品无干扰。

图1 高效液相色谱图

2.4 线性关系

取苯甲酸钠对照品和羟苯甲酯对照品各适量，精密称定，加溶剂溶解，定量稀释制成每1 mL 含苯甲酸钠0.2 mg 和羟苯甲酯0.2 mg 的混合对照品贮备溶液，分别取混合对照品贮备溶液0.50、2.5、4.0、5.0、6.0、7.5 mL，分别置10 mL 量瓶中，加溶剂稀释定容至刻度，摇匀，即得系列浓度的线性溶液。取上述溶液，按“2.1”项下色谱条件进行测定，记录色谱图。以各成分质量浓度（x,mg/mL）为横坐标，峰面积（y）为纵坐标，进行线性回归，结果见表2。

表2 回归方程与线性范围

2.5 精密度试验

取“2.2.1”项下的对照品溶液，按“2.1”项下色谱条件重复进样测定5 次，记录各色谱峰面积。结果显示，苯甲酸钠和羟苯甲酯峰面积的RSD 均为0.1%，表明仪器精密度良好。

2.6 回收率试验

用内容量移液管精密量取9 份“2.2.3”项下的阴性样品1 mL，分别置10 mL 量瓶中，分别精密加入“2.4”项下的混合对照品贮备溶液4、5、6 mL（各3 份），加溶剂稀释至刻度，摇匀，即得相对浓度为80%、100%、120%的供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进行测定，记录色谱图，按外标法计算其含量及回收率，结果见表3，表明该方法准确度高。

表3 回收率试验结果（n=9）

2.7 重复性试验

取本品（批号19111712）6 份，按“2.2.2”项下方法配制供试品溶液，并按“2.1”项下色谱条件进行测定，记录色谱图。结果显示，6 份供试品溶液中苯甲酸钠和羟苯甲酯的含量分别为100.4%和99.4%，RSD 分别为0.3%和0.2%，表明该方法重复性良好。

2.8 稳定性试验

取“2.2.1”项下的对照品溶液和供试品溶液，在样品仓温度为15 ℃条件下，考察0、24、50 h，按“2.1”项下色谱条件进行测定，记录色谱图。结果，苯甲酸钠和羟苯甲酯峰面积的RSD 均不大于1.5%。结果表明，对照品溶液和供试品溶液在15 ℃下50 h内稳定。

2.9 样品测定

取3 批复方氨酚美沙糖浆样品，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1”项下色谱条件进行测定，记录色谱图并按外标法以峰面积计算样品中抑菌剂的含量，结果见表4。

表4 样品抑菌剂含量测定结果（%）

3 结果

本试验在“2.1”拟定的色谱条件下，考察了有机相流动相比例（15%±2%）、流速（1.0±0.1 mL/min）、柱温（30±2 ℃）、波长（215±2 nm）的影响，结果显示，2 种抑菌剂与相邻色谱峰分离度均不小于3.0。拟定测定条件的小变动能满足系统适用性试验要求，表明该方法具有较好的耐用性。

本试验考察了苯甲酸钠和羟苯甲酯的滤膜吸附情况，采用微孔滤膜（品牌：津腾，材质：尼龙66，直径：13 mm，孔径：0.45 μm）分别弃去初滤液0、1、2、3、4、5 mL 后作为待测溶液，以离心处理的溶液作为无吸附溶液，计算各待测溶液与无吸附溶液峰面积计算相对偏差。结果显示，在对照品溶液和供试品溶液中，滤膜对各组分的吸附性结果一致；除在弃去0 mL 时，羟苯甲酯的相对偏差大于2.0%外，其余相对偏差结果均小于2.0%。结果表明，溶液在使用微孔滤膜过滤时，应至少弃去1 mL初滤液。

4 讨论

本试验建立了HPLC 法测定2 种抑菌剂苯甲酸钠和羟苯甲酯含量的方法，方法操作简单、专属性强、准确度高，为复方氨酚美沙糖浆的质量控制提供了参考方法。