脾肾阳虚型狼疮性肾炎血浆外泌体miRNA表达谱的分析及意义

张绍杰　　汤水福　　陈洪宇　　胡芳玉

[摘要] 目的 分析脾腎阳虚型狼疮性肾炎（LN）患者血浆外泌体miRNA表达谱的变化及探讨其可能存在的意义。方法 选取2015年8～11月于广州中医药大学第一附属医院住院的3例脾肾阳虚型LN患者，并选取健康志愿者3名作为对照组，应用高通量测序技术分析两组患者血浆外泌体miRNA表达谱的差异，应用RT-PCR技术对结果进行验证。 结果 两组的表达谱中，高显著差异的分子包括hsa-miR-127-3p及hsa-miR-4497（P<0.01）;一般显著差异的分子共6个（P<0.05）。PCR验证结果与高通量测序一致。 结论 高显著差异的血浆外泌体miRNA分子可能是脾肾阳虚型LN潜在的生物标志物;差异表达的miRNA分子可能通过促进肾纤维化、介导雌激素作用等参与LN的发生发展。

[关键词] 狼疮性肾炎;脾肾阳虚;miRNA表达谱;高通量测序

[中图分类号] R593.4          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-9701（2021）10-0027-04

Analysis and significance of plasma exosome miRNA expression profile in lupus nephritis of spleen-kidney yang deficiency type

ZHANG Shaojie1   TANG Shuifu2   CHEN Hongyu3   HU Fangyu4

1.Department of Nephrology， Dingqiao Hospital of Hangzhou， Hangzhou   310021， China; 2.Department of Nephrology， the First Affiliated Hospital of Guangzhou University of Traditional Chinese Medicine， Guangzhou   510405， China; 3.Department of Nephrology， Hangzhou Hospital of Traditional Chinese Medicine， Hangzhou   310007， China; 4.Emergency Department， Hangzhou Hospital of Traditional Chinese Medicine， Hangzhou   310007， China

[Abstract] Objective To analyze the changes of plasma exosome miRNA expression profile in patients with lupus nephritis （LN） of spleen-kidney yang deficiency type and explore its possible significance. Methods Three LN patients with spleen-kidney yang deficiency hospitalized in The First affiliated hospital of Guangzhou University of Traditional Chinese Medicine from August to November 2015 were selected. Three healthy volunteers were selected as the control group. High-throughput sequencing technique was used to analyze the difference of plasma exosome miRNA expression profile between the two groups. The results were verified by RT-PCR. Results In the expression profiles of the two groups， the molecules with high significant difference included hsa-miR-127-3p and HSA-MIR-4497 （P<0.01）. Generally， there were 6 molecules with significant differences（P<0.05）. The result of PCR was consistent with that of high-throughput sequencing. Conclusion Plasma exosome miRNA molecules with high significant difference may be potential biomarkers of LN of spleen-kidney yang deficiency type. Differentially expressed miRNA molecules may participate in the occurrence and development of LN via promoting renal fibrosis and mediating estrogenic effects.

[Key words] Lupus nephritis; Spleen-kidney yang deficiency; miRNA expression profile; High throughput sequencing

狼疮性肾炎（Lupus nephritis，LN）是继发性肾脏病变，其发生提示系统性红斑狼疮病情严重。系统性红斑狼疮的病因尚不完全明确，目前认为与遗传因素及性激素等密切相关。其主要发病机制是免疫介导产生的损伤，与多种类型的免疫细胞及细胞因子等相关。

外泌体最早是由Pan等[1]通过电镜发现的直径约40～100 nm、大小均一的脂质双分子层结构囊泡。可由淋巴细胞、树突状细胞等多种细胞分泌，广泛存在于血液、尿液、唾液、脑脊液和胆汁等体液中[2-3]。已证实其在肾脏疾病的发生发展及诊断、治疗方面均有重要的意义[4-5]。外泌体中携带mRNA、miRNA等物质，能传递细胞间的信息，并调控各种生理活动。外泌体中的miRNA分子能调控基因的表达，必然参与疾病的发生发展过程，本研究通过分析脾肾阳虚型LN患者的血浆外泌体miRNA表达谱，拟从分子生物学水平探寻此型LN潜在的发生发展机制，为其诊断及治疗提供帮助。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2015年8—11月在广州中医药大学第一附属医院肾内科住院辨证为脾肾阳虚证的LN患者3例为试验组。①诊断标准：西医诊断符合美国风湿病学会1997年推荐的诊断标准[6]。脾肾阳虚证诊断标准参照2008年中华中医药学会肾病分会制定的《狼疮性肾炎的诊断、辨证分型及疗效评定》（试行方案）制定[7]。②纳入标准：符合狼疮性肾炎西医诊断标准及中医脾肾阳虚证诊断标准，年龄不限。③排除标准：排除合并高血压、糖尿病等其他能引起肾脏损伤的疾病;排除患有混合性结缔组织病者;排除患有尿路感染等感染性疾病者。排除合并有心、脑、肝和造血系统等严重原发性疾病。另选取年龄、性别相匹配的健康志愿者3名做为对照组。本研究通过医院医学伦理委员会伦理审查，纳入研究患者均签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 血浆采集  抽取每名受试者血液8 mL，EDTA抗凝，4℃下静置3～4 h后，4000 r/min，离心15 min，收集上层血浆储存在-80℃备用。

1.2.2 外泌体的提取  收集的血浆以3000 g进行15 min的离心，完毕后将上清液提取5 mL，然后放入无菌试管中，取1.26 mL的ExoQuick试剂加入其中（广州锐博生物科技有限公司），并摇晃试管使之混合均匀，低温下冷冻30 min;常温下1500 g离心30 min，试管底的沉淀物即为外泌体。

1.2.3 总RNA的提取  分别将两组提取好的外泌体混合，加入1.0 mL TRIZOL试剂及0.2 mL氯仿混匀，静置 3～5 min;4℃及10 000 g离心力的条件下离心10 min;将上清液吸取后移至另一个EP管中，然后加入0.5 mL异丙醇，混合均匀。在-20℃条件下孵育过夜;再次4℃及10 000 g离心力离心10 min，将上清液丢弃，再加入1 mL的75%乙醇，充分混合均匀，继续在4℃及10000 g离心力下进行10 min离心;然后在室温下晾干，加入经DEPC处理过的dd H2O水30 μL，溶解RNA，-80℃存用。

1.2.4 高通量测序  用TruSeq Small RNA Sample Prep Kit來构建文库，并用 Agilent 2200 TapeStation 进行文库质检。使用Single Read Flow Cell，根据HiSeq 2500 User Guide 提供的说明进行HiSeq 2500上机操作，进行single-end（1×50）标准测序程序。进行的高通量测序及后续数据分析由广州锐博生物科技有限公司协助完成。

1.2.5 RT-PCR验证  对测序结果进行验证。以1 μg总RNA作为反应模版，按照BestarTM qPCR RT Kit提供的说明书规范进行逆转录反应体系的配置;逆转录条件：37℃，60 min;98℃，10 min。RT-PCR扩增的反应体系为20 μL：Bestar SybrGreen qPCRmasterMix  10 μL，PCR Forward Primer（10 μM）及PCR Reverse Primer（10 μM）各 0.5μL，转录产物2 μL，ddH2O 7 μL。反应条件：95℃ 2 min，94℃ 20s，58℃ 20 s，40个循环。

1.3 观察指标

通过上述试验方法检测两组血浆外泌体miRNA表达谱，筛选出差异显著的miRNA分子。

1.4 统计学处理

采用edger分析差异倍数并计算P值。差异倍数绝对值≥1即认为两组间存在差异，其中P<0.01为差异有显著统计学意义，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 差异表达的miRNA分子

经高通量测序后数据分析发现共有148个miRNA分子测出的差异倍数绝对值≥1，其中131个的表达上调（表1），而表达下调的分子仅17个（表2）;其中有2个miRNA分子具有高显著差异，分别是hsa-miR-127-3p及hsa-miR-4497;具有一般显著差异的共6个，包括hsa-miR-129-5p、hsa-miR-383-5p、hsa-miR-423-5p、hsa-miR-629-3p、hsa-miR-3158-3p及hsa-miR-3184-3p;其余均为一般差异。

2.2 PCR验证

选取高显著差异的两个分子hsa-miR-127-3p及hsa-miR-4497，行PCR检测，验证高通量测序的准确性。PCR检测结果显示，hsa-miR-127-3p及hsa-miR-4497的表达与高通量测序结果相一致，说明高通量测序结果可靠。

3 讨论

外泌体可由多种不同细胞分泌，亦相应表达其特有的蛋白，因而可根据其特异表达的蛋白来辅助相关肾脏疾病的诊断。有研究发现[8]，在早期糖尿病肾病患者中，其尿液外泌体miRNA谱与单纯糖尿病患者比较，miR-362-3p等分子表达上调，而miR-30d-5p等分子表达下调，并认为可将其作为新型生物学标志物。MiRNA分子在体内存在广泛，不同部位表达的分子并不相同。肿瘤细胞分泌的外泌体能促进肿瘤细胞的发生、发展，外泌体中表达的miRNA分子被认为可用于肿瘤的诊断[9]。关于miRNA分子作为生物标志物在LN方面的研究也有报道，在对Ⅳ型LN伴有细胞性新月体患者的一项研究发现，其尿液外泌体中miR-3135b等分子表达显著异常，并证实有很好的诊断价值，诊断特异性高达83.3%～96.6%[10]。潘妩姗等[11]证实LN患者肾组织中miR-155表达量明显升高，而miR-200a则降低，并认为二者可作为标志物来评估病情。又有一项对LN的研究发现，尿液外泌体中miR-146a水平与疾病活动度有关系，随疾病活动度增加而表达上调[12]，这些研究说明miRNA分子具有作为生物标志物的潜力。

我们临床观察到很多LN患者起病時即表现为面色苍白、全身重度浮肿、怕冷等虚证征象，通过数据统计发现这类表现为脾肾两虚的患者比例高达一半以上[13]，这类患者更容易出现肾功能下降，治疗较为棘手，早期结合中医药治疗能取得更好的效果。目前中医方面对于LN外泌体及miRNA谱的研究较少。部分LN患者，尤其是经过治疗后的，症状多不典型，辨证困难，故不能较好地指导治疗，主要是缺乏有力的客观指标支持，故探索特异表达的miRNA分子具有重要意义。本研究共筛选出148个特异表达的分子，其中miR-127-3p及miR-4497两个分子较为显著，说明二者可能是此型LN患者有意义的生物标志物，对指导临床辨证及早期治疗均可能有较大价值，需后期进一步的研究来证实。

外泌体能传递细胞间的信息，其中携带的miRNA分子能调控基因的表达，故高显著表达的hsa-miR-127-3p及hsa-miR-4497两个分子在此型LN的发生发展中可能发挥重要作用。有研究证实miR-127具有保护近端肾小管功能的作用[14]，而我们前期研究发现LN患者脾肾阳虚证较热毒证肾间质损害程度更重[15]，故脾肾阳虚型患者miR-127-3p升高可能是一种代偿性保护机制。MiR-127还能参与免疫细胞的调控，舒峤等[16]研究百令胶囊对LN的治疗作用，发现其可能通过调控miR-127的表达进而抑制巨噬细胞功能来达到缓解LN病情的目的。可见miR-127分子通过多个方面参与肾脏疾病的发生发展，在肾脏疾病中发挥重要作用，我们的研究结果也提示其显著高表达，后续我们将开展进一步的研究探讨其具体的作用机制。关于miR-4497分子在免疫疾病方面也有相关研究，研究发现原发性干燥综合征及系统性硬化症患者外周血miR-4497分子表达量均下降[17-18]，但由于研究较少，其具体作用尚不清楚，但可以肯定其在LN发生发展中必然发挥重要作用。

本研究筛选出的一般显著差异的miRNA分子在肾脏病的发病中也有重要作用。在一项关于膜性肾病的研究中，发现包括miR-423-5p在内的10个差异表达的分子，并被认为可作为潜在的诊断标志物[19]。MiR-629分子通过增加转录激活子（STAT-1）的表达而导致系统性红斑狼疮患者的肾脏损害[20]。还有研究发现miR-629等分子在肾细胞癌中过度表达，未来可能被作为治疗靶点[21]。MiR-129分子则被证实能参与小鼠肾脏纤维化的发生[22]。脾肾阳虚型LN患者病程多较长，很多患者是由于病情迁延不愈而演变为脾肾阳虚证，肾脏疾病随着病程进展大多会出现肾间质纤维化，所以miR-129分子很可能参与了LN肾脏纤维化的进程，具体作用机制需进一步研究来探讨。

本研究是对LN患者血浆外泌体中miRNA表达谱的初步研究，样本数也较少，筛选出部分显著表达的分子，但能否将其用于辅助诊断及辨证尚需行进一步研究来证实。上述分子可能通过促进肾脏纤维化、保护肾小管功能、调控信号通路等发挥其在肾脏病变中的作用，其具体的机制均是未来研究方向之一。

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（收稿日期：2020-09-22）