宫颈特殊染色法在宫颈高级别鳞状上皮内病变及以上病变筛查中的应用价值

石鑫，马秀华，宋风丽，史伟，贺笑茜，郅玲玲，于帅，马丽丽，高万里，冯力民

(1.北京市大兴区人民医院妇产科，北京 102600；2.首都医科大学附属北京天坛医院妇产科，北京 100070)

宫颈癌是威胁女性生命健康的常见恶性肿瘤。2018年全球宫颈癌新发病例约57万，死亡病例约31万[1]。2020年，世界卫生组织再次发布了《加速消除宫颈癌全球战略》，除大力推广人乳头瘤病毒(human papilloma virus，HPV)疫苗接种外，还提出有效的宫颈癌前病变筛查是阻断宫颈癌发生的重要手段[2-3]。近年来，我国在积极推进HPV疫苗接种[4]的同时，制订了《子宫颈癌综合防控指南》[5]，规范我国宫颈癌筛查流程。但由于我国各地区的经济及医疗技术水平发展不均衡，在经济发达地区宫颈癌筛查基本采用发达国家的主流方法高危型HPV和液基薄层细胞学检测(thinprep cytologic test，TCT)联合检查，而在贫困地区筛查的覆盖率较低[6]，暴露出医务人员缺乏、细胞学技术人员不足等问题[7]。因此，亟须寻找操作简单快捷的新宫颈癌筛查方法[8]。

叶酸受体介导的宫颈特殊染色法(folic acid receptor-mediated diagnosis，FRD)是近年出现的筛查宫颈高级别鳞状上皮内病变(high-grade squamous intraepithelial lesions，HSIL)及以上病变的新方法，其不需要特殊仪器设备，不需要病理医师且价格低廉，适合在我国贫困地区作为宫颈癌筛查的方法使用，但目前尚无多中心、大样本的前瞻性研究数据证实其有效性。本研究旨在分析FRD在宫颈HSIL及以上病变筛查中的应用价值，以为FRD应用于临床提供参考。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2018年1月至2019年12月在北京市大兴区人民医院妇科门诊进行宫颈病变机会性筛查，行高危型HPV检测和TCT后有任何一项结果异常的292例患者作为研究对象，年龄21～77岁，平均(41±12)岁，其中65岁以上患者8例。排除标准：①处于月经期者；②已确诊HSIL及以上病变者；③接受过宫颈手术(宫颈冷刀锥切术、超高频电波利普刀宫颈环形电切术、物理治疗等)；④宫颈有接触性出血且出血量大者；⑤已妊娠者；⑥处于急性炎症期。本研究患者均签署知情同意书。

1.2方法 TCT提示非典型鳞状上皮细胞、低级别鳞状上皮内病变、HSIL、非典型腺细胞和非典型腺细胞倾向病变或高危型HPV阳性的女性患者，在预约阴道镜检查时，对其宫颈和宫颈管行FRD并记录结果。为避免发生疑诊偏倚，先进行FRD染色，记录判读结果后再补充记录患者的病史及TCT和HPV等检查结果。FRD颈管特殊染色阳性者、细胞学非典型腺细胞者、阴道镜宫颈转化区Ⅱ、Ⅲ型者均在阴道镜下行宫颈管搔刮术。

1.2.1FRD 采用陕西高源医疗器械服务有限公司生产的FRD上皮组织特殊染色液先行宫颈管染色，再行宫颈染色。宫颈管检查时，应暴露宫颈，医用小棉签蘸取FRD上皮组织特殊染色液至饱和插入宫颈管(2.5～3 cm)，沿宫颈管内壁旋转5圈逐步下拉棉签取出，立即观察棉签颜色。宫颈检查时，用大棉签蘸取FRD上皮组织特殊染色液至饱和，用力涂抹宫颈5圈，于宫颈口按压5 s取出，立即观察棉签颜色。将棉签上颜色最重的部分(2 min内)与标准比色卡对比：①呈现淡黄棕色或浅绿色为阴性；②呈现蓝色、墨绿色和黑色为阳性，即提示存在HSIL及以上病变。

1.2.2高危型HPV检测 采用凯杰公司的HC-2 HPV DNA检测系统或凯普公司的HPV分型检测系统进行检测。结果判读：凯杰公司的HC-2 HPV DNA检测结果，HPV DNA ≥1.0 ng/L时为阳性，<1.0 ng/L时为阴性；凯普公司的HPV分型检测出14种HPV高危亚型(16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、68)为阳性，未检测出14种高危亚型为阴性[9]。

1.2.3TCT 采用美国新柏氏公司生产的液基薄层细胞采样及制片系统行TCT，结果判读采用Bethesda描述性报告系统：未见癌细胞及上皮内病变细胞；非典型鳞状上皮细胞，包括意义不明确细胞和不除外HSIL；低级别鳞状上皮内病变；HSIL；鳞状细胞癌；非典型腺细胞；非典型腺细胞倾向病变；宫颈原位腺癌；腺癌[10]。本试验中，将TCT结果提示为非典型鳞状上皮细胞(不除外HSIL)或非典型腺细胞及以上病变设为阳性，提示未见癌细胞及上皮内瘤变细胞或意义不明确非典型鳞状上皮细胞设为阴性。

1.2.4阴道镜活检 采用上海朗逸医疗器械有限公司代理的德国LEICA MZ6阴道镜在可疑宫颈病变区取活组织送病理检查。病理结果提示HSIL[宫颈上皮内瘤变(cervical intraepithelial neoplasia，CIN)Ⅱ级、CINⅢ级]及以上病变为阳性，低级别鳞状上皮内病变(CINⅠ级)及以下病变为阴性[11]。对于病理提示CINⅡ级的病例，进行P16和Ki-67免疫组织化学染色，若阴性，归入低级别鳞状上皮内病变[12]。对于后续有手术的患者，如进行宫颈冷刀锥切术、超高频电波利普刀宫颈环形电切术、子宫全切术等，应追访术后病理结果，以病理检查报告中级别最高的病变为记录结果。

1.3统计学方法 采用SPSS 19.0统计学软件进行数据处理，诊断试验的一致性采用Kappa检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1三种筛查方法与病理对照结果比较 在292例患者中，病理活检结果阳性79例、阴性213例。FRD、高危型HPV检测和TCT三种筛查方法均以病理结果为金标准，检出真阳性患者分别为49、78和51例，真阴性患者161、35和130例。FRD、高危型HPV检测和TCT三种筛查方法与病理结果的一致性检验Kappa值分别为0.346、0.089、0.210(均P<0.001)，其中FRD的符合率为71.9%(210/292)，特异度为75.6%，阳性预测值为48.5%，均高于高危型HPV检测和TCT；高危型HPV检测的符合率为38.7%(113/292)，灵敏度为98.7%，阴性预测值为97.2%，高于FRD和TCT；TCT的符合率为62.0%(181/292)。见表1。

表1 三种筛查方法与病理对照结果比较 (例)

2.2FRD的检查和病理结果 本试验中，病理结果提示HSIL及以上患者共79例，其中CINⅡ级、CINⅢ级、宫颈癌分别为40、36、3例，FRD分别检出例数为17、29、3例。若将HSIL中CINⅢ级及以上病变设为阳性，CINⅡ级及以下病变设为阴性，则病理结果阳性39例、阴性253例。FRD检出真阳性患者32例，真阴性患者184例，总符合率为74.0%(216/292)，其灵敏度为82.1%(32/39)，特异度为72.7%(184/253)，阳性预测值为31.7%(32/101)，阴性预测值为96.3%(184/191)；与病理结果的一致性检验Kappa值为0.328(P<0.001)。见表2。

表2 FRD的检查和病理结果(HSIL中CINⅢ及以上为阳性)

3 讨 论

2018年据全球肿瘤流行病统计数据显示，全球宫颈癌发病率为3.2%[13]，而我国宫颈癌发病率为3.61%[14]。在我国，宫颈癌的发病率及致死率均居于女性生殖系统恶性肿瘤首位，且呈年轻化趋势[15]。宫颈癌发展到晚期，致死率较高，严重威胁女性的生命健康[16]。由于宫颈从癌前病变到癌的自然演变病理过程需要10～20年，及早发现宫颈病变并采取针对性的治疗措施，可以阻断宫颈癌的发生[17]。美国通过宫颈癌的筛查已显著降低了宫颈癌的发病率和死亡率，预计2021年美国新发病例约14 480人，死亡约4 290人[18]。

目前普遍认为，TCT和高危型HPV检测单独应用于宫颈癌筛查均有其局限性，TCT敏感性稍差，HPV敏感性虽然好，但是特异性差[19]。本研究中，高危型HPV检测的灵敏度为98.7%、特异度为16.4%，而TCT的灵敏度为64.6%、特异度为61.0%，与上述研究结果基本一致。同时本研究结果显示，FRD的灵敏度为62.0%，与TCT相似，但是特异度更高，为75.6%，与Qi等[20]和Dai等[21]的研究结果相符。但Xiao等[22]研究认为，FRD的灵敏度高于TCT，特异度低于TCT。出现不同研究结果的原因可能与FRD结果判读存在一定的主观性有关，但FRD对于宫颈HSIL及以上病变的筛查具有和TCT一样较高的准确性，同时FRD可以极大地缩短筛查等待结果时间，所以FRD有望在部分地区取代TCT成为人群分流的方法，提高筛查的效率，节约患者的时间成本。

FRD染色剂是用于人体上皮组织肿瘤细胞的活细胞染色剂，其主要成分为叶酸、叶酸-二氢呋喃衍生物、亚甲蓝、乙酸等。FRD筛查的原理为：①叶酸受体在正常的宫颈组织中很少表达甚至不表达，但在宫颈恶性上皮组织细胞中表达明显增加[23-25]，且叶酸与叶酸受体有很高的亲和力[26]。②研究表明，肿瘤细胞处于强烈的氧化应激环境中，与正常组织相比，其存在大量的活性氧类[27]。③生物染色剂亚甲蓝与肿瘤细胞有高度亲和性，还原型亚甲蓝无色而氧化型显蓝色，亚甲蓝的氧化还原性使其在肿瘤细胞的氧化还原体系中具有不同的变色反应光谱[28]。FRD上皮组织特殊染色液中的叶酸衍生物与肿瘤细胞表面的叶酸受体结合，被内吞入胞质后，还原型亚甲蓝迅速被细胞内的活性氧类氧化为氧化型的亚甲蓝。大量生物大分子进入细胞内会使细胞内的渗透压升高，使氧化型亚甲蓝溢出胞外，透过涂抹宫颈的棉签颜色判断有无病变。因此，宫颈组织的病变级别越高，恶性度越高，其组织中叶酸受体表达水平越高，FRD染色的颜色变化也越明显，检出率越高。故FRD筛查HSIL中的CINⅢ级及宫颈癌更有优势。本研究结果显示，FRD筛查HSIL中CINⅢ级及以上病变的灵敏度为82.1%，明显高于筛查CINⅡ级及以上病变的灵敏度[62.0%(49/79)]。Xiao等[22]分析得出FRD对于筛查越高级别的宫颈病变，灵敏度越高的结论。2019年，美国阴道镜检查与宫颈病理学会建议规范病理报告分级为HSIL(CINⅡ级)、HSIL(CINⅢ级)[29]。对于部分CINⅡ级，保守治疗是可接受的[30]，而明确的CINⅢ级则建议进行治疗[31-32]。因此，基于FRD筛查CINⅢ级及宫颈癌具有更高的准确性，在临床上可以应用于偏远山区等容易失访女性的筛查，实现“即诊即治”；可以应用于已妊娠女性的筛查，避免出现其他筛查方法用毛刷获取标本容易引起阴道出血等不良反应，避免增加孕妇的心理负担和可能造成潜在的生育方面的影响；也可以作为一个高危指标，警示妇产科医师和阴道镜医师可能存在宫颈HSIL及以上病变，降低漏诊率。

综上所述，FRD筛查HSIL及以上病变的灵敏度与TCT相似，但特异度更高，尤其是筛查HSIL中CINⅢ级及宫颈癌的灵敏度更高。因此，FRD具有广泛的临床应用价值，但目前尚无大样本量的研究充分评估其灵敏度和特异度，且FRD的判读存在一定的主观性，未来如果可以实现客观判读且能够预测宫颈病变的恶性度分级，将更有利于FRD在临床推广使用。