支气管肺泡灌洗液生物标志物检测在呼吸机相关性肺炎诊治中的应用进展

周泽红，谭家余，黄湘

(1.广东医科大学，广东 东莞 523808；2.广州中医药大学附属中山中医院检验科，广东 中山 528400；3.中山市博爱医院中心ICU，广东 中山 528403；4.佛山市妇幼保健院产前诊断中心，广东 佛山 528300)

呼吸机相关性肺炎(ventilator-associated pneumonia,VAP)是指患者接受机械通气48 h后发生的感染性炎症，诊断和治疗较为困难，发病率和病死率均较高[1]。一项国内多中心、观察性的流行病学研究显示，VAP的发病率为4.5例/1 000机械通气日，28 d死亡率高达45%[2]。目前VAP的诊断方法包括临床诊断标准、临床肺部感染评分、病原微生物培养、急性生理学和慢性健康状况评价Ⅱ(acute physiology and chronic health evaluation Ⅱ,APACHEⅡ)等，然而这些方法均存在不足之处。VAP的发生极大地危害患者的生命健康，若不能尽早诊断、尽早规范治疗将严重影响患者的预后。生物标志物检测具有快速、高效的优势，可用于VAP的早期诊断和鉴别诊断。现已证明血清生物标志物如C反应蛋白(C-reactive protein，CRP)、降钙素原(procalcitonin，PCT)对下呼吸道感染的诊断具有较高的灵敏度，但在VAP的鉴别诊断方面特异度较低[3-5]。近年来研究发现，支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)中生物标志物如可溶性髓样细胞触发受体-1(soluble triggering receptor expressed on myeloid cell-1，sTREM-1)、穿透素-3(pentraxin 3，PTX3)的检测能提高VAP早期诊断的准确性，改善患者预后[6-7]。现就目前临床常用的BALF生物标志物的研究进展进行综述。

1 传统生物标志物

1.1CRP CRP是系统性炎症的急性期标志物，也可能是肺部免疫系统的局部调节剂，连续监测CRP水平已被广泛用于感染性疾病的诊断和疗效观察[8]。因BALF标本来源部位的特异性，检测BALF中CRP对VAP的诊断具有一定帮助并可联合其他生物标志物提高VAP的诊断效能；且经动态监测BALF发现CRP水平变化与疾病进程相关，即在确诊VAP时达峰值，随着病情的好转而呈下降趋势[9]。同时，CRP可联合其他炎症标志物如PCT、白细胞介素-6(interleukin-6，IL-6)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor alpha，TNF-α)用于VAP的早期诊断和疗效观察[10]。因此，CRP对VAP的诊治具有重要价值。

1.2PCT PCT已被证实为细菌性感染的早期预测和疗效观察指标，已普遍用于细菌性感染性疾病的诊断和预后评估。多个团队的研究结果显示，BALF中PCT诊断VAP的灵敏度可达55%以上，特异度在80%以上，且其浓度呈现随疾病的加重而升高、随疾病好转而降低的变化趋势，提示BALF中PCT的检测对VAP早期诊断及预后评估具有较高的应用价值[11-15]。但丁磊和王振洲[16]研究发现，疑诊VAP组、确诊VAP组及无VAP组患者BALF中PCT及CRP水平比较差异无统计学意义，而血清PCT、CRP水平比较差异有统计学意义，血清PCT、CRP可作为VAP的早期诊断指标。上述多项研究结果和结论差异较大的原因：①PCT的检测方法不同；②BALF标本采集前未排除抗生素的影响；③研究样本量不同以及BALF标本质量的差异。虽然研究结果存在争议，但综合评估后发现血清和肺泡灌洗液PCT对于VAP的早期诊断、疗效观察和预后评估仍具有潜在的应用价值。

1.3TNF-α TNF-α是早期炎症因子，由单核-巨噬细胞和淋巴细胞激活后产生，具有广泛的作用。TNF-α是肺炎早期发生发展中主要的促炎因子，引起白细胞在炎症部位聚集，早期具有一定的保护作用，一旦炎症的促炎和抑炎平衡被打破产生失控的炎症风暴就会引起肺损伤。经动物实验证实，在VAP的发生发展中，病原体可能通过Toll样受体、病原体相关分子模式通路和(或)核因子κB信号通路激活肺泡巨噬细胞产生大量的TNF-α破坏促炎和抑炎的平衡，从而募集中性粒细胞和淋巴细胞等效应细胞聚集造成肺损伤，且铜绿假单胞菌菌液滴注诱导VAP后小鼠肺组织中TNF-α以及肺泡灌洗液中TNF-α水平显著升高[17-18]。在猪VAP模型的动物实验研究中，BALF和气道分泌物培养对VAP的诊断具有较高的准确性，且联合TNF-α检测能显著提高VAP的诊断准确性[19]。程红斌[20]研究发现，VAP患儿急性期血清TNF-α水平高于恢复期和正常对照组患儿，BALF中TNF-α水平高于血清TNF-α水平，表明TNF-α作为一种早期的炎症因子参与VAP的发生发展过程。因此，BALF中TNF-α可作为VAP早期诊断和疾病预后的指标。

1.4IL

1.4.1IL-6 IL-6是一种多功能细胞因子，在急性期炎症反应、免疫反应和造血中发挥重要作用，其在感染性疾病、免疫性疾病及肿瘤等疾病中表达增加。血清IL-6可作为VAP患者预后的标志物，并且在维生素D治疗后逐渐降低，以减轻炎症损伤[21]。VAP患者肺部IL-6表达升高的机制可能是病原体通过c-Jun氨基端激酶信号通路介导的炎症反应而实现[22]。史跃杰和陈丽敏[23]检测63例新生儿VAP患儿血清和BALF中IL-2、IL-6、IL-8及TNF-α水平,并按照患儿预后情况分为预后良好组(41例)和预后不良组(22例)，发现预后不良组患儿BALF中IL-6、IL-8明显高于预后良好组，而抑炎因子IL-2水平明显低于预后良好组。由此证实，BALF中IL-6水平有助于评估VAP患者的预后。临床医师可通过检测BALF中IL-6和IL-8水平，评估VAP患儿预后情况，及时调整治疗方案，改善患儿预后。

1.4.2IL-1β IL-1β是常见的促炎因子，主要由单核细胞、巨噬细胞等免疫细胞和非免疫细胞分泌，肺部感染时，IL-1β诱导中性粒细胞和其他炎症细胞的趋化形成炎症风暴，进而引起肺损伤。IL-1β在呼吸机相关性肺损伤的发生发展中起重要作用，在呼吸机相关性肺损伤大鼠模型中证实，呼吸机相关性肺损伤大鼠的血清和BALF中IL-1β水平显著升高，并且随着抗炎药物的治疗和病情好转后逐渐下降[24]，因此，检测BALF中IL-1β水平对VAP的早期诊断具有较大帮助且能作为疗效观察指标。Morris等[25]通过分析BALF中多种炎症标志物浓度发现，以10 pg/mL为临界值时，IL-1β诊断VAP的阴性似然比为0.09；以 2 ng/mL为临界值时，BALF中IL-8诊断VAP的阳性似然比可达5.03，BALF中IL-1β、IL-8是目前VAP鉴别诊断的最强标志物。这一发现对VAP患者抗生素的管理具有潜在的应用价值。

1.4.3IL-8 IL-8是单核-巨噬细胞、上皮细胞受感染、炎症等刺激而分泌的趋化因子，对中性粒细胞具有较强的趋化作用，在肺部感染性疾病的发生发展中扮演重要角色[26]。BALF中IL-8的检测在成人和新生儿VAP的诊断中均展现出较好的应用价值，邓毅等[27]对新生儿VAP与非VAP患儿BALF和血清IL-1、IL-6、IL-8等炎症标志物检测发现，两组通气48、96 h BALF中上述炎症标志物比较差异有统计学意义，并随着时间的推移各炎症标志物在VAP组BALF中逐渐升高，其中IL-8变化最显著。由此可见，IL-8可作为新生儿VAP的诊断指标。

IL-8的检测还可用于VAP的排除性诊断，并指导抗生素管理，即早期检测到VAP患者BALF中IL-1β、IL-8水平低于设定的阈值时停用抗生素。Hellyer等[28]对12个重症监护病房、大样本量的研究证实IL-1β是较好的VAP预测指标，并且发现联合检测IL-1β、IL-8对VAP排除性诊断的灵敏度为100%，特异度为44.3%，测试后概率为0%。根据这一结果该团队随后提出假设：若BALF中IL-1β、IL-8低于之前设定的诊断临界值，能减少抗生素的使用，并于2013年注册实施了17个医院、24个重症监护病房的多中心双盲随机对照试验对该假设加以证实[29]。但IL-8等炎症标志物在VAP患者抗生素管理方面的作用需要更多随机对照试验加以验证。

1.5中性粒细胞弹性蛋白酶(neutrophil elastase，NE) NE是丝氨酸蛋白酶超家族成员之一，来源于中性粒细胞、单核细胞、T 淋巴细胞和肥大细胞。在VAP的病理机制中，中性粒细胞大量聚集于肺泡并释放大量的NE等蛋白水解酶，NE是重要的炎症损伤因子，是引起急性肺损伤炎症级联反应的主要终效应因子，其主要通过消化和降解细胞外基质及上皮连接结构导致肺损伤。在VAP患者BALF中观察到NE的质量和活力均显著升高，以670 ng/mL为临界值，NE诊断VAP的灵敏度为93%、特异度为79%[30]。BALF中NE水平与VAP的进展具有相关性，在未发生VAP前血清和BALF中NE水平较低，发生VAP时血清和BALF中NE水平显著增高，随着治疗进行和病情好转，血清和BALF中NE水平下降，但在病情恶化和死亡患者血清和BALF中NE持续升高；且BALF中NE水平与临床肺部感染评分、血清CRP、PCT以及全血白细胞呈正相关，提示BALF中NE的检测对于VAP的诊断、疗效观察和预后评估具有较高的应用价值[31]。NE水平和活性增加而NE抑制剂浓度和活性下降导致肺炎患者难以康复，NE抑制剂的应用能改善此状况、促进细胞因子的适量释放及病原菌的清除[32]。提示NE可作为VAP治疗的新靶标。

2 新型生物标志物

2.1sTREM-1 sTREM-1是表达于中性粒细胞和单核/巨噬细胞表面的受体，属于免疫球蛋白超家族成员，可在血液以及体液中检测到。sTREM-1是近年来发现的感染性疾病早期诊断的敏感性指标，机械通气72 h后发生VAP的患者血清sTREM-1水平显著高于非VAP患者，以165.05 pg/mL为临界值时，机械通气72 h的sTREM-1诊断VAP的灵敏度为90%，联合PCT检测能显著提高诊断的灵敏度和特异度，因此血清sTREM-1可作为VAP的可靠预测指标[33]。BALF中sTREM-1水平诊断VAP的灵敏度和特异度均高于血清CRP、PCT和sTREM-1，而且sTREM-1水平与APACHEⅡ评分均可评估患者预后[34]。BALF中sTREM-1作为VAP的早期预测指标在儿童VAP人群中也展现出较高的应用价值[35]。BALF中sTREM-1在成人和儿童VAP的诊断中均展现出良好的应用前景，且sTREM-1刺激剂为脂多糖，预示着sTREM-1水平可能与细菌的种属有关，但需更多高质量的研究加以验证，以使临床应用标准化。

2.2PTX3 PTX3是由381个氨基酸残基组成的五肽相关蛋白，属于五聚蛋白家族的急性期蛋白，由巨噬细胞、中性粒细胞和髓样树突状细胞等组织细胞合成和分泌，常参与机体早期的抗感染反应及异物清除。目前已有研究发现，血清PTX3水平在感染、炎症等情况下会显著升高[36-37]。一项纳入961例样本的Meta分析结果显示，PTX3诊断呼吸道感染的综合灵敏度为0.78、特异度为0.73，综合受试者工作特征曲线下面积为0.84；亚组分析显示血清和BALF中PTX3诊断呼吸道感染的综合受试者工作特征曲线下面积分别为0.85和0.89，PTX3诊断VAP的综合受试者工作特征曲线下面积可达0.89，表明PTX3诊断呼吸道感染及VAP具有中等的诊断准确性，BALF中PTX3的总诊断价值优于血清[38]。因此，BALF中PTX3的检测有助于VAP的早期诊断。

2.3淀粉酶 误吸是机械通气患者发生VAP的重要致病机制，包括口咽部分泌物和胃内容物的误吸。口咽部分泌物中淀粉酶为唾液淀粉酶，胃内容物中的淀粉酶可能来自胰腺，因此无论口咽部分泌物误吸还是胃内容物误吸，BALF中均有可能检测到淀粉酶水平升高。Samanta等[39]研究发现，插管后72 h内发生VAP的患者盲法BALF淀粉酶水平显著升高，并随插管前、插管后误吸风险因素的增加而增加。Qu等[40]对147例机械通气超过2周的老年患者气道分泌物淀粉酶进行检测后也得出相似的结论。淀粉酶作为快速灵敏的指标，已达到自动化分析的程度，对具有误吸风险的VAP患者的诊治具有重要意义。

2.4肝素结合蛋白(heparin-binding protein，HBP) HBP又称为天青杀素，是来源于多形核白细胞的重要颗粒蛋白，在炎症过程中大量释放并具有杀菌、趋化及调节作用。健康人血清中HBP水平较低，一般不超过10 μg/L，发生感染时，菌体本身或细菌释放的毒素等物质刺激中性粒细胞释放HBP，从而导致HBP水平升高[41-42]。血清HBP对感染性疾病的诊断具有较高的敏感性和特异性，血清HBP水平升高也有助于VAP的诊断和预后评估，并且HBP联合APACHEⅡ评分早期诊断VAP的诊断价值优于PCT联合APACHEⅡ[43]。但BALF中HBP检测对VAP诊断的研究较少见报道，其原因可能为标本采集较困难。

2.5胰石蛋白 胰石蛋白由胰腺腺泡细胞合成和分泌，是胰腺的分泌产物，以可溶形式分布于生理状态的胰腺组织、胰液和血清中，其生物学作用尚不清楚，被证实在感染性疾病特别是ICU脓毒症患者诊断和预后研究中具有较高的应用价值[44]。血清中胰石蛋白水平能作为VAP的诊断指标和预后指标[45]，梁添书等[46]连续监测疑诊VAP患者第1、4、7、14天及停呼吸机时血清胰石蛋白水平发现胰石蛋白水平随VAP的进展而升高，治疗后浓度下降，因此胰石蛋白可作为VAP诊断和预后评估指标。BALF中胰石蛋白的检测有助于VAP的早期诊断，且BALF中胰石蛋白诊断VAP的受试者工作特征曲线下面积可达0.91，具有较高的灵敏度和特异度[47]。胰石蛋白除在胰腺中高表达外，在肝、肾、脑和肺中也存在高表达，且肺组织是其主要表达区域[48]。因此，BALF中的胰石蛋白可作为VAP的早期诊断指标。

2.6肺泡表面活性物质蛋白D(alveolar surface active substance protein D，SP-D) SP-D是一种丰富的肺表面活性剂相关蛋白，在肺的局部防御和免疫调节等过程中起重要作用，可与多种肺病原体结合，增强肺部调理作用而清除病原体。SP-D不仅可增强固有免疫细胞对病原体的清除，调节细胞因子和炎症反应，还可以调节适应性免疫应答并与多种肺部疾病密切相关。王鹂鹂等[49]研究发现，肺炎患儿BALF中SP-D水平显著升高，且与BALF中中性粒细胞数量呈负相关，提示SP-D作为一种保护性因子在调节免疫及炎症反应中发挥着重要作用。

SP-D是新进发现的肺部特异性标志物，诊断肺部疾病的特异性较高，在VAP的诊断中具有潜在的应用价值。Said等[50]通过检测儿科机械通气患儿BALF中SP-D并计算临床肺部感染评分发现，BALF培养阳性患儿BALF中SP-D水平显著高于培养阴性组患儿；与感染肺炎克雷伯菌或金黄色葡萄球菌的患儿相比，感染铜绿假单胞菌的患儿SP-D水平增加更显著，SP-D水平与细菌种属相关；BALF中SP-D水平升高先于临床肺部感染评分和BALF培养结果变化。Tekerek等[51]对成人VAP和非VAP患者血清中CRP、PCT、PTX3和SP-D水平进行比较发现，血清SP-D是诊断VAP最敏感的生物标志物，可作为鲍曼不动杆菌和铜绿假单胞菌的早期特异性生物标志物。

3 生物标志物的联合检测

单个生物标志物检测对VAP诊断的敏感性和特异性均不能满足临床需求，易出现漏诊情况，因此，主张多种标志物联合检测。Grover等[52]通过比较确诊VAP、非VAP、无机械通气无感染患者BALF和血清中多项生物标志物水平的差异，筛选并构建了包含BALF单核细胞表面髓样细胞触发受体-1与血清单核细胞表面髓样细胞触发受体-1比值、BALF单核细胞表面人整合素AM(mCD11b)与血清单核细胞表面人整合素AM(mCD11b)比值、BALF sTREM-1、IL-8、IL-1β以及血清CRP、IL-6的7项生物标志物的组合模型，该模型能准确鉴别出VAP患者。Antcliffe等[53]检测VAP患者血清中包含细胞因子、氧化脂类等51种炎症标志物的结果显示，5,6-二羟基二十碳三烯酸、8,9-二羟基二十碳三烯酸、细胞间黏附分子-1、IL-6和IL-8的多元模型可以鉴别VAP患者与无感染的脑损伤患者，标志物联合检测VAP的诊断价值更高。

4 小 结

BALF中生物标志物可反映肺部炎症的严重程度，对VAP的早期诊断和预后评估具有较高的应用价值。但生物标志物检测受BALF标本质量、抗生素、检测方法的影响，因此，后续研究应由专业熟练的医师采集BALF标本、统一检测方法、排除抗生素对各个标志物检测的影响，增加样本量以及采用随机对照试验的方法对BALF生物标志物在VAP诊治中的应用价值加以证实。VAP患者BALF中多种生物标志物浓度显著升高，但其升高的具体机制尚未清楚，且各个标志物的检测尚未标准化。若能解决以上两个问题，BALF中生物标志物有望成为VAP诊断、疗效观察及预后评估的重要指标。