儿童造血干细胞移植后EB 病毒相关淋巴组织增殖性疾病 的诊疗进展

习必鑫，胡 群

华中科技大学同济医学院附属同济医院儿童血液科（湖北武汉 430030）

EB 病毒（Epstein-Barr virus，EBV）是一种自然界中广泛存在的γ 疱疹病毒，容易感染人类B 淋巴细胞，全世界50%～ 89%的儿童和90%以上的成年人可以检测出血清EBV-IgG阳性[1]。对于免疫功能正常的个体，体内EBV 特异性细胞毒性T 细胞（cytotoxic T-lymphocyte，CTL）可以有效控制EBV 感染，从而长期处于EBV 感染的无症状潜伏期；但是当人体免疫功能障碍时，如造血干细胞移植后，患儿可能出现顽固性EBV 血症，甚至进展为致命性的EBV 相关淋巴组织增殖性疾病（EBV related post-transplant lymphoproliferative disorder，EBV-PTLD）[2]。对234个移植中心的18 014例患者分析发现，造血干细胞移植（hematopoietic stem cell transplant，HSCT）术后PTLD的病死率为84.6%[3]。PTLD 的传统治疗包括使用抗病毒药物、免疫抑制剂逐渐减量、供体淋巴细胞输注（donor lymphocyte infusion，DLI）等，但治疗效果并不理想，而且完全缓解率低。近年来，随着特异性CD20靶向药物，利妥昔单抗的成功应用，联合化疗、EBV特异性CTL、嵌合抗原受体T细胞治疗（chimeric antigen receptor T-cell therapy，CAR-T）等治疗方式均被证实可显著改善EBV-PTLD患者的预后[4]。

1 EBV-PTLD发病机制

EBV可通过其靶受体CD21感染人体 B淋巴细胞，在宿主免疫功能正常时绝大部分被感染的B淋巴细胞会被EBV特异性的CTL和自然杀伤细胞清除，极少部分被EBV感染的静息记忆B淋巴细胞逃过免疫追踪。拥有近100 组基因序列的EBV 通过限制自身核酸序列的表达，从而阻止CTL对感染的静息B淋巴细胞的识别，使宿主长期处于无症状感染期。此外，EBV 还可以通过表达潜伏期膜蛋白（latent membrane protein，LMP）激活静息B 淋巴细胞中的JAK/STAT 通路，从而上调共抑制受体PD-L1的表达[1]。当EBV与PD-1受体结合后，CTL 无法识别EBV，导致免疫失能。尽管人体EBV潜伏感染很常见，但仍有少部分个体会发展为与EBV相关的淋巴瘤，这类人群通常受种族、地理位置、生活环境、遗传免疫和感染等因素的影响。

当患者特异性T 淋巴细胞免疫系统受损时，被EBV感染的B淋巴细胞生存期延长，进一步增加了B淋巴细胞变异的可能性，比如BCL 6、MYC、NF-kB、PI 3 K/AKT/mTOR、BCL 2等变异，甚至可能导致淋巴细胞组织从早期多态型淋巴瘤病变逐步发展到更高危类型的单克隆或寡克隆淋巴瘤病变[1]。实体器官移植或HSCT 创造了一种独特的免疫功能障碍环境，为受者体内感染EB 病毒的B 淋巴细胞逐渐演变成PTLD提供了适宜条件。此外，早发型PTLD具有EBV依耐性，晚发型PTLD 并不具有EBV 依耐性[5]。大部分EBV 阳性的PTLD 发生在移植后前6 个月内，而EBV 阴性的PTLD 则多发生于移植5 年以上的患者。在基因组水平上，两者也存在着显著差异：免疫系统正常时，EBV阴性患者与弥漫性大B细胞淋巴瘤具有相同的基因组特征，而EBV 阳性患者则没有这类特 征[6]。此外，EBV 阴性的PTLD 比EBV 阳性的PTLD存在更多更复杂的分子畸变。尽管EBV阳性的PTLD和EBV阴性的PTLD之间存在明显的差异，但是它们对治疗有着相似的反应，即EBV的感染状态似乎并不影响PTLD的预后。

2 EBV-PTLD危险因素

近年来，多项研究发现供体的来源、供受者HLA抗原的匹配程度、减低强度的预处理（reduced intensity conditioning，RIC）、移植物抗宿主病（graft-versushost disease，GVHD）、抗胸腺球蛋白（antithymocyte globulin，ATG）的使用、T细胞去除（T cell depletion，TCD）、脐血移植（umbilical cord blood trarsplantation，UCBT）、脾切除及供受者EBV 血清学错配等危险因素均可以明显增加EBV-PTLD的发生风险，并且随着危险因素数量在移植受体的累积，其EBV-PTLD发生的相对风险值（Relative Risk,RR）呈非对称性的几何倍数增长[1,3,5,7]。见表1。

2.1 降低预处理强度

对于再生障碍性贫血或先天性免疫缺陷病患者，临床医生为了降低预处理药物的毒性和受体HSCT后的早期死亡率，通常会选择减低强度的预处理方案。对1 021 例移植患者的分析发现，其中4%患者发生PTLD，证实RIC是发生PTLD的独立危险因素[7]。RIC对PTLD发病风险的影响也可以用EBV对B淋巴细胞的趋向性来解释。移植患者接受RIC后，体内EBV感染的淋巴细胞由于缺乏正常EBV 特异性CTL 的免疫限制，其自由转化期明显延长。与清髓性预处理方案相比，RIC受体需要更高强度的抗排异治疗，因此更容易出现特异性T细胞重建延迟[8]。此外，研究发现，接受RIC方案移植的患儿中，9例中仅1例在移植后6个月，10 例中7 例在移植后1 年，可以检测到EBV 特异性CTL，而标准清髓方案（myeloablative conditioning，MAC）处理移植的患儿中，9 例中有6 例在移植后6个月、10 例均在移植后1年，可以检测到EBV 特异性CTL[3]。

2.2 HLA抗原相合程度

供体和受体HLA 抗原不匹配导致PTLD 发生的分子机制目前仍不清楚。但是，研究发现，HLA 抗原错配的移植受者比HLA 抗原全相合移植受者发生EBV-PTLD 的风险更高[7]。此外，有2 个或以上HLA抗原位点不匹配或无关供者的移植受体发生PTLD的风险明显高于HLA 全相合或仅有1 个HLA 抗原位点不匹配同胞供体的移植患者[5]。但是，也有研究发现，HLA -I类抗原与EBV-PTLD的发生没有相关性[1]。

表1 EBV-PTLD危险因素

2.3 抗胸腺球蛋白或T细胞去除

近年来单倍体半相合受体HSCT 的数量不断增加，为了降低受体移植后GVHD 的发生率和严重程度，移植前ATG或TCD的使用也越来越多；但研究发现，ATG 或TCD 的使用均可能导致EBV 复燃，从而增加PTLD 发生风险[1,9]。根据抗体生产方式和动物来源不同，ATG 包括兔抗-ATG-G、兔抗-ATG-F、马抗-ATG-G、马抗-ATG-F 等，一项针对儿童HSCT 的回顾性研究证实，5～10 mg/kg ATG-G和20～60 mg/kg ATG-F在免疫重建方面没有明显差异，但是后者会导致更高的PTLD发生率[10]。此外，兔抗-ATG还可以引起更强的淋巴细胞耗竭。非选择性的TCD常用阿伦单抗（抗CD52抗体）或者密度梯度离心来处理移植物采集物，它可以大量清除T 淋巴细胞，其中也包括EBV特异性CTL。由于特异性T淋巴细胞的减少与EBV感染、巨细胞病毒（CMV）感染均密切相关，而且移植前使用TCD 的受者PTLD 发生率高[3]，因此，国内大部分医疗中心很少使用TCD。

2.4 移植物抗宿主病

GVHD是受体HSCT常见的并发症，持续的抗原刺激，会诱发炎症性细胞因子风暴，从而导致受体特异性免疫系统重建延迟[11]。同时，抗排异药物的免疫抑制治疗也会增加受体感染的风险。因此，GVHD是患者HSCT 后发生EBV-PTLD 的又一个独立危险 因素[5,12]。单因素和多因素分析显示，Ⅱ～Ⅳ级急性GVHD 和慢性GVHD 患者发生EBV 血症的风险显著增高，而且GVHD 越严重PTLD 发生风险也 越高[7,13]。

2.5 脐血移植

UCBT具有低输入性感染风险、低GVHD发生率等优点，而且随时可用，因此适用于先天性免疫缺陷病以及与供者HLA 抗原错配的移植患者。UCBT、骨髓移植和外周血干细胞移植后EBV 相关并发症的发生率没有明显差异。但是，研究显示，使用RIC预处理方案的UCBT 患者PTLD 发生率为6%～7%，而使用RIC+ATG 预处理方案的UCBT 患者PTLD 发生率则高达21%[1]，因此，需要加强对UCBT患者血清EBVDNA 载量的监测，必要时可预防性使用利妥昔单抗 治疗。

2.6 CMV感染

移植受体HSCT 后，免疫功能处于抑制状态且白细胞数量低下，容易感染各种病原微生物，包括细菌、真菌、病毒和寄生虫等。其中，CMV与骨髓抑制、GVHD、EBV再活化等一系列移植后并发症密切相关。研究人员通过多变量分析发现，CMV 再活化也是预测EBV再激活和PTLD发生的一个独立危险因素[14]。

2.7 脾切除

脾是人体免疫系统非常重要的一个组成部分，它是T细胞、B细胞和免疫球蛋白产生的重要场所。脾切除会损害CD 5+B 细胞的免疫功能，可能诱发EBV 的活化和爆发性增殖。研究发现，脾切除是EBV-PTLD发生的独立危险因素[15]。

2.8 其他危险因素

全身放疗、基础疾病（比如重型再生障碍性贫血、非霍奇金淋巴瘤等）、年龄、移植+30d CD4+淋巴细胞数量、供受体EBV血清学不匹配、移植后环磷酰胺的使用等均被证实为PTLD 危险因素[1,3,5,7]。此外，有研究表明，多个EBV-PTLD 危险因素累积时，其发病的RR显著升高，患者的发病时间显著缩短；当累积的危险因素≥2个时，EBV-PTLD发生的风险是对照组（0个危险因素）的43倍，其发病的中位时间缩短到移植后9.6个月[5,7]。

3 EBV监测及预防

3.1 EBV监测

健康个体的外周血单核细胞中很容易检测到EBV-DNA，而血浆中游离的EBV-DNA 检测通常为阴性，此时宿主处于EBV 感染的潜伏期。但是，血浆EBV-DNA 阳性时则表明其可能来源于被EBV 感染的死亡肿瘤细胞、死亡的潜伏感染的B淋巴细胞或者EB 病毒体。因此，通过聚合酶链反应（PCR）监测血浆EBV 载量对于早期发现EBV 血症、淋巴细胞组织增生性疾病显得十分重要。根据最新的血液病多中心临床指南建议[16]，移植后患者血细胞重建时，就应开始监测血浆EBV-DNA，一般为移植后2周左右，每周 1 次，至少监测到受体细胞免疫重建4 个月后。若EBV-DNA检测阳性，则监测频率改为每周2次。

3.2 EBV感染的预防

移植预处理前即给予患儿静脉输注更昔洛韦，预防性抗病毒治疗；造血干细胞回输-1 d，调整更昔洛韦为阿昔洛韦静脉输注，至少持续至造血细胞完全植入。对于供者为单倍体半相合及预处理方案包含ATG的移植受体，移植前可以考虑预防性使用利妥昔单抗治疗（375 mg/m2）[1]。

4 EBV-PTLD诊断

4.1 临床表现

≥1 项临床症状：无法解释的持续发热（体温≥38.0 ℃）、阵发性头痛、频繁呕吐、持续腹泻、间断性血便、四肢乏力等；临床工作中以无明确病因的发热更多见。≥1项阳性体征：扁桃体肿大、咽喉部淋巴滤泡组织明显增多增大、浅表淋巴结肿大、肝脾肿大、皮肤巩膜黄染等；临床工作中以颈部、腋窝、腹股沟等部位的淋巴结肿大更多见。

4.2 影像学检查

根据患者的疾病状态，可以选择双侧颈部、双侧腋窝、胸部、腹部、盆腔、双侧腹股沟等肿块常见部位行B 超、CT 扫描、核磁共振成像（MRI）、正电子发射计算机体层显像仪（positron emission tomography and computed tomography，PET-CT）检查来明确病变的大小和性质。对于有持续呕吐、腹痛、腹泻、消瘦等症状的患儿，可以考虑行经消化道内镜检查及活检。

4.3 实验室检验

连续两次血清或脑脊液EBV-DNA ≥104拷贝/mL、克隆性免疫球蛋白重链或T细胞受体基因重排阳性、外周血出现异型淋巴细胞、外周血血细胞计数明显降低（累及骨髓时可出现一系或多系血细胞减少）、乳酸脱氢酶（LDH）≥3倍正常值上限等。

4.4 组织病理活检

选取肿大的组织包块（优先选择氟代脱氧葡萄糖高代谢富集区域）进行病理活检，EBV-PTLD 的组织病理学特征[16]包括：淋巴细胞异常增殖导致结内或结外组织结构的破坏、免疫组化标记显示为单克隆或寡克隆细胞群、组织细胞（非血液成分）中可以检测出EBV 核酸或EBV 编码蛋白（2016 年欧洲白血病感染会议指南[16]推荐具有高灵敏性、高特异性的原位杂交技术来检测EBV编码的小RNA,EBV-encoded small RNA,即EBER），确诊EBV-PTLD必须符合上述三种组织病理学特征中的两种，此为诊断EBV-PTLD的金标准；其具体的病理类型可参照2016年世界卫生组织更新的PTLD组织病理学分类[17]。

5 临床治疗进展

5.1 EBV血症的治疗

卧床休息，清淡饮食，维持水、电解质平衡及内环境稳定，监测体温、血压、心率等生命体征变化。根据病情监测血常规、血生化（心肌酶谱、肝功能、肾功能、电解质等）、凝血功能、血糖、血清EBV-DNA、血清CMV-DNA、外周血T/B/NK细胞EBV核酸分选，必要时复查胸部CT及淋巴结B超等检查。

抗病毒治疗，更昔洛韦+膦甲酸钠或者阿昔洛韦+膦甲酸钠静脉输注，其中膦甲酸钠用药过程中须给予水化，总液体量2 000～2 500 mL/m2。

连续2次血清学EBV-DNA≥104拷贝/mL，即可考虑给予患儿抗排异药逐渐减量联合利妥昔单抗抢先治疗（375 mg/m2，每周1次，1～4周）。

5.2 EBV-PTLD的治疗

在对症支持治疗的基础上，积极防治移植后并发症；尽快完善PET-CT、组织病理活检，EBV-PTLD一旦确诊，立即给予患儿化疗或者细胞免疫治疗。

5.2.1 化疗 利妥昔单抗（抗CD 20+特异性单克隆抗体）目前已成为临床上治疗早期非破坏性PTLD、多形性破坏性PTLD 及单形性破坏性PTLD（包括弥漫大B 细胞淋巴瘤样PTLD）的标准化疗药物。利妥昔单抗可以有效治疗EBV-PTLD，其作用机制主要包含两个方面：①靶向清除CD20+的肿瘤细胞；②高效耗竭体内B淋巴细胞，明显消减了EBV感染的B淋巴细胞，从而相对提高受者体内EBV特异性T淋巴细胞的比例，促进机体抗病毒及抗肿瘤的免疫反应[1]。近年来，国内多中心治疗儿童EBV-PTLD化疗方案并不一致，包括R-CP、R-CHOP 及SC-EPOCH 等化疗方案，其中减低剂量的R-CP 方案[第1、2 疗程，环磷酰胺 600 mg/m2d1，甲基泼尼松龙 1.6mg/（kg·d）iv d1-d5；利妥昔单抗 375mg/m2d1、d8、d15；第3～6疗程，环磷酰胺 600mg/m2d1，甲基泼尼松龙 1.6mg/（kg·d）iv d1-d5]应用较广泛，但是该治疗方案的安全性和有效性仍在进一步完善中。

5.2.2 细胞免疫治疗 EBV 特异性CTL 免疫疗法，对于利妥昔单抗耐药或者复发的EBV-PTLD 治疗效果显著。如果供体来源的EBV-CTL 无法获得或者供体血清EBV 阴性，可以选择与第三方HLA 抗原全相合的EBV-CTL 来治疗EBV-PTLD，也能获得很好的长期完全缓解[1,18]。CAR-T 免疫疗法，通过基因转导使患者的T细胞能够表达嵌合抗原受体CAR，然后将改造后的CAR-T 细胞回输给患儿，从而靶向清除肿瘤细胞。目前的CAR-T 治疗主要针对CD 19、CD 20、CD22三个靶向位点。DLI，即血清学EBV-IgG阳性的供体淋巴细胞输注，在受体T细胞免疫功能完全重建之前，也可以有效治疗EBV-PTLD，但是有研究报道EBV-PTLD患者接受DLI治疗后，GVHD发生率高达17%[1]，因此临床诊疗过程中须密切关注由于DLI 引发严重GVHD的风险。

综上，EBV-PTLD是儿童HSCT后的一种严重并发症，进展迅速，死亡率高，预后差。由于儿童PTLD发病率低、相关的临床试验少、治疗方案不一致，因此，目前国际上还没有形成统一的EBV-PTLD治疗方案。尽管多中心临床试验正在寻找新的治疗方式和靶向药物，但是仍有太多未知的困难，还需要进行更多的前瞻性研究来完善儿童EBV-PTLD 治疗的有效性和安全性。