基于公共数据库分析MFAP2在食管癌中表达及其预后意义

孙文 舒扬

1常州市第四人民医院检验科，江苏213000；2江苏大学附属医院中心实验室，镇江212000

食管癌是世界上第八大癌症，同时病死率在癌症相关死亡中排名第六［1］。食管癌有80%的病例发生在欠发达的发展中国家，其中亚洲和非洲发病率最高［2］。食管癌通常被诊断出来就已是晚期阶段，主要原因是癌症早期缺乏典型的临床症状以及与其他相关疾病症状相似而被漏诊。患有晚期疾病患者最常见的症状是会出现进行性吞咽困难或无意识的体质量减轻［3］。全球食管癌患者5年总体生存率为15%～20%［4］，所以提高疾病的早期诊断率有助于降低病死率。本文的研究目的就是要寻找到一个新的食管癌预后生物标志物。

微纤维相关糖蛋白2（MFAP2）存在于许多组织的细胞外基质中，是弹性蛋白相关微纤维的主要抗原，可与原纤维蛋白相互作用以调节微纤维的功能，也是遗传性结缔组织病的病因。目前的科学研究表明，MFAP2在很多肿瘤中的表达增高，例如胃癌［5］、黑色素瘤［6］、头颈部鳞状细胞癌，但MFAP2在食管癌中表达及预后文献报道少见。本研究首先检索Oncomine及GEPIA数据库中有关MFAP2在食管癌中的表达信息，然后利用在线网站UALCAN从多个角度分析MFAP2在不同临床信息的食管癌患者组织样本中的mRNA表达，并通过Kaplan-Meier Plotter在线分析MFAP2在食管癌中的表达与临床预后的相关性；最后通过STRING构建目的基因蛋白互作网络，以期了解MFAP2在食管癌中的功能作用，为寻找新的食管癌早期诊断指标、预后标记物及潜在的治疗靶点提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 MFAP2在Oncomine数据库中的表达Oncomine数据库（https：//www.oncomine.org/）是一个全世界知名的肿瘤基因数据库，可以直接生成可视化图片结果，其高效能的分析能力和大量储存样本保证分析结果具有较大的参考价值。首先登录Oncomine数据库，然后进行检索条件的设置：（1）Input：Esophageal cancer；（2）Gene：MFAP2；（3）Select the analysis type：cancer vs.normal。通过上述搜索可以获得有关MFAP2的数据集，然后进行具体分析。

1.2 MFAP2在GEPIA数据库中的表达GEPIA数据库（http：//gepia.cancer-pku.cn/index.html）是基于癌症和正常基因表达谱分析的一个公共数据库。其数据来源于TCGA以及GTEx项目的肿瘤和正常样本的RNA测序数据，可以进行非常全面地表达分析。首先打开GEPIA在线软件，在differential genes下的Dateset选择ESCA，其余默认|log2FC|Cutoff：1，q-value cutoff：0.01，选用ANOVA方法，最后点击List，即可得出ESCA的差异表达基因。

1.3 MFAP2基因在人食管癌和正常组织中的表达分析UALCAN（http：//ualcan.path.uab.edu/index.html）是一个可以公开访问的癌症数据在线分析网站，可以用来验证新的生物标志物，提供基因表达水平、生存分析、相关性分析。利用UALCAN在线分析软件分析MFAP2基因在食管癌及正常癌组织中的表达。在软件主页输入MFAP2基因，选择食管癌组织，获得MFAP2在正常组织和食管癌组织中的差异表达，本研究将从原发食管癌原发组织、不同种族、不同性别、不同年龄阶段、不同分期、不同分级、不同的抽烟状态、TP53是否突变与正常邻近组织的表达情况等多个角度分析MFAP2的表达差异。

1.4 生 存 分 析Kaplan-Meier Plotter（http：//www.kmplot.com/）是一个新的生物预后指标分析工具，数据来源于GEO、EGA和TCGA数据库，为了分析特定基因在肿瘤的预后价值，根据拟议生物标志物的各种分位数表达，将患者样品分为两组。通过Kaplan-Meier生存图比较这两个患者队列，并计算95%置信区间和logrankP值的危险比。首先登录Kaplan-Meier Plotter在线数据库，输入MFAP2基因，分别选择在食管腺癌和食管鳞癌中进行总生存分析。

1.5 构建PPI网络STRING（http：//string-db.org/）是一个搜寻已知和预测蛋白质之间相互作用的数据库，可以用于分析基因组学的数据、蛋白质结构的注释，探索预测目的基因蛋白的相互作用。数据来源于收集和重新评估有关于目前现有的实验数据，已知数据库中的蛋白质复合物［7］，然后再Search框中输入MFAP2基因，物种选择“Homo sapiens”进行搜索，在“settings”中选择minimum required interaction score为0.04，最后在“Exports”中下载。

2 结 果

2.1 MFAP2在各种肿瘤中的表达在Oncomine数据库中收集到了430项有关MFAP2基因表达在正常组与肿瘤组的研究数据集，其中MFAP2表达差异有统计学意义的数据集一共有107项，有104项MFAP2表达增高，3项表达降低。而在食管癌的研究中只有4项表达增高，未有表达降低的研究数据集（图1）。

2.2 MFAP2在食管癌中的表达在Oncomine数据库中共找到4项MFAP2在食管癌中表达增高的数据集。这些数据集发表的杂志分别是Clinical Cancer Research、BMC Genomics、Cancer Research和PLoS One。笔者通过对找到的4项有关MFAP2在食管癌中表达增高的数据集中进一步分析，发现与正常组相比，MFAP2在食管癌中显著高表达（P＜0.05）（表1）。为了验证以上分析结果，笔者进一步挖掘分析GEPIA数据库，在differential genes中找到食管癌数据集中的差异基因，其中包含了MFAP2基因（log2FC=2.897，校正P=8.86E-57），发现MFAP2基因在食管癌中的表达上调。

图1 Oncomine数据库中MFAP2基因在肿瘤中的整体表达情况

2.3 MFAP2基因在不同临床信息的食管癌组织及正常组织中的表达利用UALCAN数据库分析MFAP2基因在不同临床信息的食管癌组织与正常组织中的表达差异。通过上述UALCAN数据库的分析，笔者发现和正常组织相比，MFAP2基因在21～60岁人群、1级食管癌患者、吸烟的食管癌患者中显著上调（图2）。

2.4 MFAP2在食管癌中的生存预后分析为了探索MFAP2与食管癌之间的生存预后关系，利用Kaplan-Meier Plotter在线网站，分别获得MFAP2在食管腺癌及食管癌的临床样本，并进行总生存分析。根据目的基因的表达差异将其分为高表达组与低表达组，结果发现MFAP2基因在高表达组的食管腺癌患者生存率较低（P=0.035），而MFAP2的表达水平与食管鳞状细胞癌患者生存预后之间不存在相关（P=0.066）（图3）。

通过在线数据库Kaplan-Meier Plotter进一步探索MFAP2在不同食管腺癌中的生存预后关系，对不同临床样本信息的食管腺癌患者进行生存预后分析：在男性，调节性T细胞富集、富含2型辅助性T细胞的食管腺癌患者中生存率较低，预后相对较差。而在巨噬细胞富集的食管癌患者中生存率较高，预后较好（图4）。

2.5 PPI网络构建通过STRING数据库构建MFAP2基因的PPI网络用于探索MFAP2基因的功能，共发现10个与之相关的功能蛋白（图5）。其中纤维蛋白1（FBLN1）引起了注意，FBLN1是一种分泌的糖蛋白，已整合到纤维状细胞外基质中，需要钙结合来介导其与层粘连蛋白和硝态素的结合。FBLN1通过结合纤维蛋白原介导血小板粘附。FBLN1在结肠癌［12］、肝癌［13］中已有相关报道。这个蛋白基因也被证实与食管腺癌的发生发展和预后有关［14］。为了进一步确定它们之间的关系，笔者通过在线软件GEPIA进行Spearman相关分析，结果发现MFAP2与FBLN1的表达为正相关（图6）。

3 讨 论

食管癌是一个极具侵略性和较差存活率的异质性疾病，由于其遗传学病史及较低的早期诊断率，是全世界面临的健康问题之一，也是中国最常见的恶性肿瘤之一［15］，在我国各种恶性肿瘤中病死率占居第4位。在中国有一个明显的特征，就是城市与农村的食管癌患者分布不一致，农村地区的食管癌患者的发病率远高于城市地区的患者［16］。食管癌发生的主要危险因素有吸烟、饮酒、肥胖、胃食管反流、饮食习惯等。其中食管腺癌发生的主要危险因素是肥胖、胃食管反流，反流症状越频繁、越严重、持续时间越长，风险就越大。吸烟和饮酒是食管鳞状细胞癌患者的两大危险因素，常见于发达国家［17］。越来越多的研究证据表明，对食管癌分子组成的全面理解不仅需要关注肿瘤细胞，而且还需要关注肿瘤微环境，其中包含多种细胞群、信号传导因子以及与肿瘤细胞相互作用并支持肿瘤各个阶段的结构分子［18］，了解食管癌的发生发展对于其诊断和治疗非常重要。笔者运用生物信息学的方法对以上数据库进行分析挖掘，发现MFAP2在食管癌中表达上调以及MFAP2高表达的食管腺癌患者的生存率低。

近年来，有关MFAP2基因在肿瘤中过表达的报道越来越多，而未见其在食管癌中的研究报道。本研究利用公共数据库Oncomine在线分析发现MFAP2基因在食管癌中的表达增高。通过GEPIA数据库在线对目的基因MFAP2进行差异分析，进一步验证了这一结论。为了进一步了解MFAP2在不同临床病理信息的食管癌患者中的表达情况，笔者利用UALCAN数据库在线分析，结果发现和正常的食管组织相比，MFAP2在21～60岁的人群，分级为1级的患者中，抽烟的食管癌患者中MFAP2基因上调更显著。利用Kaplan-Meier Plotter数据库进行在线分析，把MFAP2基因按表达水平分为两组，分别为表达上调组和表达下调组，在表达上调组的食管腺癌患者总体生存率较差；然而MFAP2的表达水平与食管鳞状细胞癌患者生存预后之间不存在相关。笔者通过在线数据库Kaplan-Meier Plotter又进一步探索MFAP2在不同临床信息及不同免疫细胞浸润的食管腺癌患者中的预后分析，结果显示：在男性、调节性T细胞富集、富含2型辅助性T细胞的食管腺癌患者中生存率较低，预后相对较差。而在巨噬细胞富集的食管癌患者中生存率较高，预后较好。通过STRING数据库在线构建MFAP2基因的蛋白互作网络，为研究目的基因的功能提供线索，结果发现共有10个预测的功能蛋白与MFAP2相互作用，其中FBLN1蛋白基因被证实与食管腺癌的发生发展有关，食管腺癌中FBLN1发生了复杂的染色体重排并产生了新型融合转录本。利用GEPIA数据库对MFAP2与FBLN1基因进行Spearman相关分析，发现MFAP2与FBLN1的表达为正相关的关系，说明MFAP2基因可能影响食管腺癌患者的预后，也有可能会引起染色体的重排。通过对MFAP2基因在食管癌中表达及预后进行全面分析，发现MFAP2具有重要的研究意义，MFAP2基因作为一种细胞外基质蛋白［19］，可能与调节性T细胞、2型辅助性T细胞等免疫细胞共同影响着食管腺癌的肿瘤微环境［18］，同时也可能成为食管腺癌的一个新的生物学指标以及潜在的治疗靶点。

表1 MFAP2在食管癌研究中的过度表达情况

图2 MFAP2在不同临床信息的食管癌组织中的差异表达（A为正常食管组织比原发食管癌，B为正常食管组织比不同年龄段的食管癌，C为正常食管组织比不同分级的食管癌，D为正常食管组织比不同抽烟状态的食管癌）

图3 MFAP2在食管腺癌与食管鳞状细胞癌中的预后生存曲线（A为MFAP2在食管腺癌中的预后生存曲线，B为MFAP2在食管鳞状细胞癌中的预后生存曲线）

图4 MFAP2在不同食管腺癌中的生存预后关系（A为男性食管腺癌患者的MFAP2表达，B为巨噬细胞富集患者的MFAP2表达，C为调节性T细胞富集患者的MFAP2表达，D为富含2型辅助性T细胞患者的MFAP2表达）

图5 构建MFAP2基因相关的蛋白互作网络

图6 MFAP2基因与FBLN1的表达呈正相关

总之，本研究通过综合公共数据库的数据信息进行深入挖掘，提出MFAP2可能是食管癌中的潜在的促癌基因，且生存分析发现MFAP2与食管腺癌患者预后有关，与食管鳞状细胞癌患者的预后不相关，同时MFAP2可能与免疫细胞共同影响着食管腺癌的肿瘤微环境。构建MFAP2蛋白互作网络，结果提示MFAP2极有可能与染色体的异常有关。生物信息学的快速发展加快了科学研究者们研究的步伐［20］，但由于其缺乏实验数据的佐证，不能更深入验证MFAP2在食管腺癌中作用机制。所以MFAP2在食管腺癌中的发生发展机制及其具体功能还有待进一步研究。