春季和秋季4个种源青钱柳叶中总黄酮及粗多糖含量比较

郑 敏，黄 颖，汪建中，丁满萍，李晓红，，邵剑文，，①

(1.安徽师范大学：a.生命科学学院，b.重要生物资源保护与利用研究安徽省省级重点实验室，安徽 芜湖 241000；2.安徽省绩溪县雄路苗圃，安徽 宣城 242000)

青钱柳〔Cyclocaryapaliurus(Batal.)Iljinsk〕隶属于胡桃科(Juglandaceae)青钱柳属(CyclocaryaIljinsk)，为高大落叶乔木。青钱柳为第四纪冰川孑遗树种，被称为“植物界的大熊猫”，是中国特有的单种属植物，也是国家重点保护野生植物[1]。青钱柳叶中含有丰富的黄酮类、多糖类和萜类等化学成分[2]，具有抗癌、抗氧化、增强机体免疫力、降血糖、降血脂和保护肝脏等保健作用[3-9]，已成为食品和药品工业研究的热点[10]。目前，市面上的青钱柳产品主要是春季嫩叶所制的茶，而秋季叶制作的茶口感和卖相均欠佳，基本无茶叶生产价值。柏明娥等[11]发现，青钱柳叶中的总黄酮和粗多糖含量随生长过程(即成熟度升高)而改变，因此，探究青钱柳叶中具有药用和保健价值的化学成分含量峰值期对于选择青钱柳叶适宜采摘期，充分发挥其保健作用具有重要意义。

研究发现，不同种源植物的总黄酮和粗多糖含量差异较大[12-13]。鉴于此，以湖南张家界国家森林公园、江西铜鼓县、江西修水县和安徽五溪山自然保护区4个种源青钱柳叶为研究对象，对春季(5月份)和秋季(9月份)各种源叶中的总黄酮和粗多糖含量进行比较，以期明确不同种源青钱柳叶中总黄酮和粗多糖含量在春季和秋季的差异，为不同用途青钱柳叶的适宜采摘期确定和优良种源筛选提供参考依据。

1 材料和方法

1.1 材料

于2015年9月至10月，分别采集湖南张家界国家森林公园(东经110°36′23″、北纬29°32′12″)、江西铜鼓县(东经114°22′02″、北纬28°31′08″)、江西修水县(东经114°32′48″、北纬29°01′35″)和安徽五溪山自然保护区(东经117°39′32″、北纬29°57′28″)4个种源的青钱柳种子。参照尚旭岚等[14]的方法进行种子萌发和种植，由安徽师范大学邵剑文教授鉴定。于2017年4月17日，将幼苗移植到安徽绩溪县雄路苗圃基地(东经118°32′24″、北纬29°59′24″，海拔160 m，年均温16.2 ℃，年均降水量1 531.5 mm，年均日照时数1 801.8 h，土壤为黄红壤)。于2019年5月15日，每个种源选择10株样株，每株采集生长良好且无病虫害的叶片约60 g；自然风干过夜，在35 ℃条件下烘干约1 h，将同株的样品粉碎后混匀，密封保存于塑封袋中。于2019年9月8日，按照上述方法再次采集相同样株的叶片并进行相同的处理和保存。

实验使用的芦丁标准品(批号170402)和葡萄糖标准品(批号160415)均购自上海展云化工有限公司，且均为分析纯；使用的主要仪器有CLT-1型电子调温电热套〔邦西仪器科技(上海)有限公司〕、索氏提取器(扬州市沪武玻璃仪器厂)和V-1200紫外-分光光度计(上海美谱达仪器有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 标准曲线绘制 用体积分数80%乙醇将芦丁标准品溶解并配制成质量浓度0.20 mg·mL-1母液，用体积分数80%乙醇分别稀释成0.00、0.04、0.08、0.12和0.16 mg·mL-1溶液，与母液组成系列梯度溶液，待测；用纯净水将葡萄糖标准品配制成质量浓度0.10 mg·mL-1的母液，用纯净水分别稀释成0.00、0.02、0.04、0.06和0.08 mg·mL-1溶液，与母液组成系列梯度溶液，待测。采用紫外分光光度法[15]分别在415和490 nm下测定芦丁和葡萄糖系列梯度溶液的吸光值，均重复检测3次。以吸光值为纵坐标(y)、标准品溶液质量浓度为横坐标(x)绘制标准曲线，并拟合回归方程。其中，芦丁标准曲线的回归方程为y=10.111x-0.015(R2=0.999 0)，该回归方程在0.00～1.00 mg·mL-1范围内线性关系良好；葡萄糖标准曲线的回归线性方程为y=10.355x+0.060(R2=0.996 6)，该回归方程在0.00～1.00 mg·mL-1范围内线性关系良好。

1.2.2 总黄酮和粗多糖提取 精确称量干燥的青钱柳叶粉末3.000 g，每株3份。按固液比1∶40加入石油醚，于60 ℃脱脂1 h；加入120 mL体积分数80%乙醇，于80 ℃浸提1.5 h，抽滤，滤液为总黄酮提取液；用体积分数80%乙醇定容至120 mL，待测。挥干滤渣，加入120 mL蒸馏水，于90 ℃浸提1.5 h，抽滤，滤液为粗多糖提取液；用蒸馏水定容至120 mL，待测。

1.2.3 总黄酮和粗多糖含量测定 参考相关文献[15-16]，将待测液在室温下4 000 r·min-1离心10 min；精确量取1 mL上清液，稀释至适宜浓度，按上述方法分别在415和490 nm下测定待测液的吸光值，并计算待测液中总黄酮和粗多糖的浓度。按公式“某成分含量=该成分质量浓度×稀释倍数×120/3.000”分别计算青钱柳叶中总黄酮和粗多糖的含量。

1.3 数据统计分析

采用EXCEL 2010和SPSS 19.0软件对相关数据进行统计、方差分析和差异显著性分析。

2 结果和分析

方差分析结果表明：青钱柳叶中总黄酮含量在春季和秋季间差异显著(P<0.05)，且在不同种源间差异极显著(P<0.01)；其粗多糖含量在春季和秋季间差异极显著，在不同种源间差异也极显著。

分析结果(表1)表明：春季各种源青钱柳叶中总黄酮含量显著低于秋季，且春季叶中总黄酮含量平均值(20.50 mg·g-1)显著低于秋季(22.38 mg·g-1)。在春季，湖南张家界国家森林公园种源叶中总黄酮含量最高，江西铜鼓县种源次之，且这2个种源叶中总黄酮含量显著高于安徽五溪山自然保护区种源。在秋季，湖南张家界国家森林公园种源叶中总黄酮含量最高，显著高于江西修水县和安徽五溪山自然保护区种源；江西铜鼓县种源次之，仅显著高于安徽五溪山自然保护区种源。

表1 春季和秋季供试4个种源青钱柳叶中总黄酮及粗多糖含量的比较

由表1可见：春季各种源青钱柳叶中粗多糖含量均高于秋季，且春季湖南张家界国家森林公园、江西铜鼓县和江西修水县种源叶中粗多糖含量显著高于秋季；春季叶中粗多糖含量平均值(30.84 mg·g-1)显著高于秋季(23.74 mg·g-1)。在春季和秋季，4个种源叶中粗多糖含量均表现为湖南张家界国家森林公园种源最高，江西省铜鼓县种源次之，且这2个种源叶中粗多糖含量显著高于江西修水县和安徽五溪山自然保护区种源。

3 讨论和结论

本研究结果表明：青钱柳叶中总黄酮和粗多糖含量在春季和秋季间以及不同种源间均存在显著(P<0.05)或极显著(P<0.01)差异。在春季，青钱柳叶中总黄酮含量平均值(20.50 mg·g-1)显著低于秋季(22.38 mg·g-1)，而粗多糖含量平均值(30.84 mg·g-1)却显著高于秋季(23.74 mg·g-1)。据此认为，若以青钱柳叶中总黄酮为主要有效成分开发抗菌、增强免疫等功效的产品，建议在秋季采摘叶片；若以青钱柳叶中粗多糖为主要有效成分开发降血糖、抗氧化等功效的产品，建议在春季采摘叶片。不论在春季还是秋季，湖南张家界国家森林公园和江西铜鼓县种源青钱柳叶中总黄酮和粗多糖含量均较高，并且这2个种源叶中粗多糖含量显著高于江西修水县和安徽五溪山自然保护区种源。春季和秋季湖南张家界国家森林公园和江西铜鼓县种源青钱柳叶中总黄酮含量明显高于同季节金银花(LonicerajaponicaThunb.)叶中总黄酮含量(9.72 mg·g-1)[17]，并接近小叶锦鸡儿(CaraganamicrophyllaLam)6月份叶中总黄酮含量(22.23 mg·g-1)[18]。春季和秋季4个种源青钱柳叶中粗多糖含量平均值为22.76～33.68 mg·g-1，均高于安徽舒城和四川沐川种源(分别为12.20和21.7 mg·g-1)[19]。

综上所述，应根据青钱柳叶不同利用目标选择适宜的采摘时间，春季宜以粗多糖为利用目标，秋季宜以总黄酮为利用目标。并且，应将湖南张家界国家森林公园和江西铜鼓县种源作为青钱柳叶总黄酮和粗多糖利用研究的重点对象。