高温胁迫对野扇花植株生长及叶中生理生化指标和极性代谢产物的影响

张俊波，李志怡，孙 清，杜红梅

(1.上海交通大学设计学院，上海 200240；2.上海市闵行区三农综合服务中心，上海 201109)

野扇花(SarcococcaruscifoliaStapf)，又名清香桂，为常绿灌木，具有较强的耐寒性[1-2]和耐阴性[3-4]，可在长江中下游地区露地越冬[2]。该种是城市园林绿化的理想植物，常作为地被和绿篱等[2]。

长时间高温不利于植物生长，致使植物生理生化代谢水平失衡[4]。植物体受到胁迫后，膜脂过氧化程度加剧，丙二醛(MDA)含量和电解质外渗率增大，膜蛋白损伤加剧[4]。高温条件下，植物体内的抗氧化酶系统会发生响应，以清除体内的活性氧，保护膜系统[5]；高温还可影响植物代谢产物的积累[6]。

作者在前期研究中发现夏季高温可引起野扇花叶片枯黄、脱落(未发表)，不利于其推广应用。为此，本研究对模拟高温(日温35 ℃、夜温30 ℃)胁迫下野扇花植株生长及叶中生理生化指标的变化进行了分析，并对野扇花叶片极性代谢产物的积累状况进行了比较，以期明确野扇花的耐热性，为野扇花在长江中下游地区的栽培应用提供参考。

1 材料和方法

1.1 材料

实验材料为上海迪士尼度假区的2年生野扇花盆栽苗，株高50～55 cm，盆栽基质为园土和河沙的混合基质(体积比2∶1)。于2019年3月移至温室进行过渡培养。培养条件为温度18 ℃～30 ℃，空气相对湿度60%～80%，自然光照；每周浇1次水。

1.2 方法

1.2.1 处理方法 过渡培养30 d后，选择株高和叶片状态相近，且无机械损伤和病虫害的植株，置于培养箱内适应培养1周后进行实验。高温处理组日温35 ℃、夜温30 ℃，对照组日温25 ℃、夜温20 ℃。每盆1株，每组6盆，每盆视为1个重复。其余培养条件为空气相对湿度75%～85%，光合有效辐射315 μmol·m-2·s-1，光照时间14 h·d-1；每2 d浇1次水。实验期间，观察各组植株生长变化；在处理0、8、16、24和32 d分别采集植株的叶片，待测。

1.2.2 生理生化指标测定 采用二甲基亚砜法[7]测定叶中叶绿素和类胡萝卜素的含量。参照Da Costa等[8]的方法，使用FE30电导率仪(美国Mettler-Toledo公司)测定叶的电解质外渗率。参照Zhang等[9]的方法，测定叶中MDA含量以及超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)和抗坏血酸过氧化物酶(APX)活性。每个指标重复测定4次。

1.2.3 极性代谢产物提取及含量分析 叶片总代谢物提取参照Du等[10]的方法并稍作修改；参照Qiu[11]的方法，以2 mg·mL-1核糖醇为内标，使用7890A-5975C 气质联用仪(美国Agilent公司)进行分析；采用NIST 2011谱库分析总离子流色谱图，根据化合物峰面积和内标峰面积计算极性代谢产物的相对含量。

1.3 数据处理和统计分析

使用EXCEL 2019和SPSS 21.0软件进行数据处理和统计分析，采用one-way ANOVA法进行方差分析，采用Duncan’s新复极差法进行多重比较。应用SIMCA 14.1软件对极性代谢产物进行主成分分析；采用偏最小二乘判别分析(PLS-DA)对极性代谢产物进行筛选，选出变量投影重要性值(VIP)大于1且在处理组和对照组间差异显著的极性代谢产物。

2 结果和分析

2.1 高温胁迫对野扇花植株生长的影响

实验观察发现，长时间(32 d)高温(日温35 ℃、夜温30 ℃)胁迫后，野扇花大部分叶片明显干枯、变黄，甚至萎蔫、脱落；而对照组(日温25 ℃、夜温20 ℃)植物生长良好，新叶继续萌发。

2.2 高温胁迫对野扇花叶中生理生化指标的影响

2.2.1 对叶绿素和类胡萝卜素含量的影响 高温(日温35 ℃、夜温30 ℃)胁迫下野扇花叶中叶绿素和类胡萝卜素含量的变化见表1。结果显示：在高温处理8、24和32 d，处理组叶中叶绿素含量显著(P<0.05)低于对照组(日温25 ℃、夜温20 ℃)，分别为对照组的96.24%、81.38%和66.49%；在处理24和32 d，高温处理组叶中类胡萝卜素含量也显著低于对照组，分别为对照组的90.48%和68.18%。随着处理时间延长，高温处理组叶中叶绿素和类胡萝卜含量总体上逐渐下降，且在部分处理时间差异显著；而对照组叶中叶绿素和类胡萝卜素含量变化均不明显。

表1 高温胁迫下野扇花叶中叶绿素和类胡萝卜素含量的变化

2.2.2 对丙二醛(MDA)含量和电解质外渗率的影响 高温胁迫下野扇花叶中MDA含量和电解质外渗率的变化见表2。结果显示：在处理16、24和32 d，高温处理组叶中MDA含量显著高于对照组，分别为对照组的1.15、1.15和1.28倍；在处理8、16和24 d，高温处理组叶的电解质外渗率显著低于对照组，分别为对照组的88.53%、86.88%和90.94%，但在处理32 d却显著高于对照组，为对照组的1.64倍。随着处理时间延长，高温处理组叶中MDA含量逐渐升高，电解质外渗率则表现为在处理8 d低于处理0 d，之后逐渐升高，并在处理32 d显著升高；而对照组叶中MDA含量和电解质外渗率变化均不明显。

表2 高温胁迫下野扇花叶中丙二醛(MDA)含量和电解质外渗率的变化

2.2.3 对抗氧化酶活性的影响 高温胁迫下野扇花叶中超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)及抗坏血酸过氧化物酶(APX)活性的变化见表3。结果显示：在处理24和32 d，高温处理组叶中SOD活性显著高于对照组，分别为对照组的3.01和5.07倍；在处理16、24和32 d，高温处理组叶中POD活性显著低于对照组，分别为对照组的92.25%、65.80%和86.18%；在处理8、16、24和32 d，高温处理组叶中APX活性显著高于对照组，分别为对照组的1.21、2.63、2.27和2.61倍。随着处理时间延长，高温处理组叶中SOD活性总体呈不断升高的趋势；POD活性呈先下降后升高的趋势，在处理24 d时达到最低值；APX活性呈先升高后降低并趋于平稳的趋势，在处理16 d时达到最高值。然而，对照组叶中SOD、POD和APX活性则随处理时间延长无明显变化。

表3 高温胁迫下野扇花叶中超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)及抗坏血酸过氧化物酶(APX)活性的变化

2.3 高温胁迫对野扇花叶中极性代谢产物的影响

为了明确短时间(8 d)和长时间(32 d)高温(日温35 ℃、夜温30 ℃)胁迫对野扇花叶中极性代谢产物的影响，采用GC-MS技术对短时间和长时间高温胁迫下野扇花叶中的极性代谢产物进行了分析，共分离鉴定出80种极性代谢产物，包括13种有机酸类成分、15种氨基酸类成分、42种糖和糖醇类成分、6种胺类成分以及4种其他成分。对这些成分进行主成分分析，结果见图1。结果显示：主成分1占比35.90%，能够将短时间和长时间高温胁迫下野扇花叶中的极性代谢产物完全分开。说明高温胁迫可影响极性代谢产物的积累，且长时间高温胁迫对野扇花叶中极性代谢产物积累的影响更大。

：短时间对照(日温25 ℃、夜温20 ℃)处理Short time control(day temperature of 25 ℃ and night temperature of 20 ℃)treatment；：短时间高温(日温35 ℃、夜温30 ℃)处理Short time high temperature(day temperature of 35 ℃ and night temperature of 30 ℃)treatment；：长时间对照处理Long time control treatment；：长时间高温处理Long time high temperature treatment.相同颜色圆点代表同组的4个重复Dots of the same color represent four replicates of the same group.

依据变量投影重要性值大于1且在处理组和对照组间差异显著(P<0.05)的标准，从80种极性代谢产物中选出22种差异极性代谢产物，包括4种有机酸类成分、7种氨基酸类成分、10种糖和糖醇类成分及1种不饱和脂肪酸类成分，详见表4。

表4 基于PLS-DA法的高温胁迫下野扇花叶中差异极性代谢产物相对含量的变化分析

结果显示：有机酸类成分中，高温处理组叶中莽草酸和4-羟基丁酸相对含量在处理8 d显著低于对照组(日温25 ℃、夜温20 ℃)，琥珀酸、苹果酸和4-羟基丁酸相对含量在处理32 d也显著低于对照组。说明野扇花叶中莽草酸和4-羟基丁酸的积累在短时间高温胁迫下明显减少，琥珀酸、苹果酸和4-羟基丁酸的积累在长时间高温胁迫下也明显减少。

氨基酸类成分中，高温处理组叶中脯氨酸、天冬氨酸和蛋氨酸相对含量在处理8 d显著低于对照组，丝氨酸相对含量在处理32 d也显著低于对照组，而亮氨酸、γ-氨基丁酸、脯氨酸、色氨酸和天冬氨酸相对含量在处理32 d却显著高于对照组，分别为对照组的4.40、1.86、1.91、1.40和1.31倍。说明野扇花叶中脯氨酸、天冬氨酸和蛋氨酸的积累在短时间高温胁迫下明显减少，丝氨酸的积累在长时间高温胁迫下也明显减少，而γ-氨基丁酸、脯氨酸、色氨酸和天冬氨酸的积累在长时间高温胁迫下却明显增加。

糖和糖醇类成分中，高温处理组叶中肌醇半乳糖苷、肌醇、1-脱氧戊糖醇和甘露糖相对含量在处理8 d显著高于对照组，分别为对照组的20.37、2.85、1.52和2.78倍，而甘露醇、阿洛糖、阿拉伯呋喃糖和赤藓糖相对含量在处理8 d却显著低于对照组；该组叶中赤藓糖相对含量在处理32 d显著低于对照组，而肌醇半乳糖苷、肌醇、1-脱氧戊糖醇、甘露糖、阿拉伯糖、甘露醇、果糖和阿洛糖相对含量在处理32 d却显著高于对照组，分别为对照组的34.30、21.42、10.71、4.98、3.16、2.21、1.79和1.67倍。说明野扇花叶中甘露醇、阿洛糖、阿拉伯呋喃糖和赤藓糖的积累在短时间高温胁迫下明显减少，赤藓糖的积累在长时间高温胁迫下也明显减少，而肌醇半乳糖苷、肌醇、1-脱氧戊糖醇和甘露糖的积累在短时间高温胁迫下却明显增加，肌醇半乳糖苷、肌醇、1-脱氧戊糖醇、甘露糖、阿拉伯糖、甘露醇、果糖和阿洛糖的积累在长时间高温胁迫下也明显增加。

不饱和脂肪酸类成分仅有α-亚麻酸1种，高温处理组叶中α-亚麻酸相对含量在处理8 d显著高于对照组，为对照组的3.10倍，而在处理32 d与对照组无显著差异。说明野扇花叶中α-亚麻酸的积累在短时间高温胁迫下明显增加。

3 讨论和结论

叶绿素和类胡萝卜素与植物的光合作用息息相关。本研究中，高温(日温35 ℃、夜温30 ℃)胁迫处理8、16、24和32 d，野扇花叶中叶绿素含量均低于对照组(日温25 ℃、夜温20 ℃)，且在部分处理时间显著低于对照组，这可能与叶绿素合成受阻[12]和(或)降解加速[13]有关，具体原因有待进一步深入研究。类胡萝卜素在植物体内参与清除活性氧过程，并且，可保护叶绿素免受光氧化[14]。随着高温胁迫持续，野扇花叶中类胡萝卜素含量总体上逐渐下降，且在处理24和32 d显著(P<0.05)低于对照组，这可能与野扇花在受到高温胁迫后体内产生大量活性氧有关。

植物在受到高温胁迫时，体内会产生大量的自由基，这些自由基与不饱和脂肪酸发生反应，生成丙二醛(MDA)等产物，破坏细胞膜结构，从而影响植物体正常的生理活动[4]。随着高温胁迫持续，野扇花叶中MDA含量不断升高且总体上显著高于对照组，在处理32 d达到对照组的1.28倍；而在处理32 d，处理组叶的电解质外渗率显著高于对照组，表明高温胁迫32 d，野扇花叶细胞的细胞液外渗严重，细胞膜结构损伤严重。

糖在植物生长和胁迫适应过程中发挥着重要作用，可直接参与其他化合物合成和能量产生，还能够参与膜稳定、基因表达调节和糖敏感信号系统调控[10]。高温胁迫下，植物体内参与植物细胞结构组成和代谢调控的糖类化合物(如蔗糖、葡萄糖和果糖等)含量会发生改变[10]。高温胁迫32 d，野扇花叶中甘露糖和甘露醇的相对含量较对照组显著升高，可能与体内的L-半乳糖途径中维生素C的合成相关，维生素C可作为非酶抗氧化剂参与植物生理发育调控[16-17]。高温胁迫32 d，野扇花叶中APX活性较对照组显著增强，证明甘露糖含量升高还可能与AsA合成有关。肌醇为环状糖醇，既是一种渗透调节剂，也是多种代谢途径(如应激反应等)的二级信使[18]；肌醇半乳糖苷是植物体内重要可溶性糖棉子糖类寡糖(RFOs)的合成底物，而RFOs的相关代谢产物可能参与植物信号转导。相关研究表明：肌醇半乳糖合酶广泛参与植物对非生物逆境胁迫的响应[19]。高温胁迫8和32 d，野扇花叶中肌醇半乳糖苷和肌醇的相对含量显著升高，推测野扇花的磷酸肌醇代谢途径受高温胁迫影响显著。

值得注意的是，高温胁迫8 d，野扇花叶中α-亚麻酸相对含量显著高于对照组。已有研究表明：膜脂肪酸饱和程度与植物抗逆性有关，不饱和脂肪酸水平较高可能是植物适应高温胁迫的一种保护机制[20]；膜脂肪酸不饱和程度增加有利于稳定植物体的光合能力，提高植物的耐热性[21]。

总体来看，高温胁迫下，野扇花大部分叶片干枯、变黄，甚至萎蔫、脱落；叶中叶绿素和类胡萝卜素含量逐渐下降，MDA含量逐渐升高，电解质外渗率仅在处理32 d显著升高，SOD和APX活性增强，POD活性减弱。高温胁迫下，野扇花叶中22种差异极性代谢产物较对照组发生显著变化，并且，胁迫时间越长，变化越大，据此认为这些差异极性代谢产物可能在野扇花响应和抵抗高温胁迫过程中发挥重要作用，影响野扇花抗高温的能力。综上所述，野扇花对高温胁迫较为敏感，且长时间高温胁迫对野扇花叶中差异极性代谢产物积累的影响更大。然而，关于野扇花叶中差异极性代谢产物在植株响应高温胁迫中的作用尚不清楚，有待进一步深入研究。