基于合成致死策略治疗三阴性乳腺癌研究进展

杜欣娜 戚家峰 张虎

(1江苏医药职业学院基础医学部，江苏 盐城 224005；2佳木斯大学基础医学院；3哈尔滨市儿童医院心胸外科)

在全球新增癌症中死亡率排名前5位的癌症类型分别是肺癌、结肠直肠癌、胃癌、肝癌、乳腺癌。女性中发病率和死亡率最高的均是乳腺癌〔1，2〕。经典的乳腺癌分型为：雌激素受体(ER)阳性、人表皮生长因子受体(HER)2阳性和三阴性乳腺癌(TNBC)。TNBC占比为15%～20%，好发于年轻女性(<50岁)，组织学分级较高，侵袭性强，易发生内脏转移和脑转移，生存期短且预后差〔3，4〕。尽管内分泌治疗和靶向治疗显著提高了ER+和HER2+乳腺癌患者群体的存活率，但TNBC主要以细胞毒性化疗为主，仍然缺乏较为理想的治疗措施，因为传统的细胞毒性和靶向治疗都无法产生良好的临床疗效，原因可能归咎于遗传异质性、对治疗的快速进化反应、信号通路互补及反馈回路〔5〕。因此临床上迫切需要开发新的TNBC治疗靶点和方法。合成致死可以看作细胞的一种表型，同时敲除、沉默或者突变两个基因，细胞发生凋亡或者坏死，如果只改变其中一个基因的功能，细胞可以正常生存〔6〕。突变是肿瘤发生的主要诱因，包括TNBC在内的各种肿瘤也存在广泛的基因突变。一些重要信号通路或生物学过程中的关键基因发生突变，失去原有功能，为开发合成致死治疗策略和靶点提供了前提，其优势在于基于该靶点开发的药物可以特异性杀伤肿瘤细胞。因为正常细胞不存在关键基因的突变，即使药物作用于靶点，细胞也会通过关键基因发挥功能存活下来〔7〕。近十几年来，合成致死策略为治疗TNBC开辟了新途径。

1 基于乳腺癌易感基因(BRCA)/聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(PARP)-1合成致死研究

1.1DNA损伤修复类型 截至目前，已发现5种DNA损伤修复机制：直接修复、碱基切除修复(BER)、错配修复(MMR)、双链断裂重组修复和核苷酸切除修复〔6〕。BRCA参与双链断裂重组修复〔8〕，PARP参与碱基切除修复〔9〕。

1.2BRCA参与双链断裂重组修复 大多数TNBC伴有BRCA突变、DNA甲基化改变、mRNA和蛋白表达改变，DNA同源重组(HR)修复异常〔10〕。化疗药物或辐射引起 DNA断裂损伤。MRN复合体(Mre11、RAD50和NBS1)识别双链断裂(DSBs)，结合DNA断裂末端，活化并招募ATM丝氨酸/苏氨酸激酶，MRN复合体连同CtIP和BRCA1切除DNA末端。RPA复合体覆盖单链DNA末端，同时，以BRCA1和PALB2依赖的方式招募BRCA2，进而招募RAD51，替换RPA，在单链DNA上形成核蛋白纤维，在同源姐妹染色单体上寻找同源序列并起始DNA链间互换〔8，11〕。

1.3PARP1参与碱基切除修复(BER) PARP是一个酶家族，PARP1和PARP2在碱基切除修复过程中发挥重要作用。PARP1具有3个保守结构域：NH2-末端DNA损伤传感器和含有锌指的结合结构域、自动修正结构域和一个C-末端催化结构域。PARP1通过结合结构域识别并结合单链断裂点(SSBs)，催化腺苷二磷酸核糖与NAD+反应生成不同大小的腺苷二磷酸核糖聚合物，进而形成长的支链聚腺苷二磷酸核糖，共价结合PARP1、组蛋白和其他DNA修复蛋白，邻近DNA断裂点形成多聚体。该多聚体携带负电荷，形成支架，招募其他蛋白，如XRCC1、DNA连接酶3、DNA聚合酶β，通过BER途径修复SSB损伤〔6，12〕。如果腺苷二磷酸核糖聚合受阻或者BER被破坏，SSBs累积，就会在DNA复制叉处形成DSBs。

1.4BRCA/PARP1合成致死 同源重组是修复DNA双链损伤的主要机制，BRCA1/2蛋白是同源重组修复途径的关键组分，BRCA缺陷的肿瘤细胞存在天然的DNA修复缺陷。同时，抑制PARP1酶的作用将会引起高水平的DNA损伤，促进细胞凋亡，即BRCA/PARP1合成致死〔13〕。抑制合成致死靶点可以增加抗癌药物敏感性。对于BRCA突变的乳腺癌或者卵巢癌患者，存在先天DNA损伤修复缺陷，抑制PARP1酶活性可以通过合成致死策略达到良好的治疗效果和较低的副作用〔13，14〕。

PARP1抑制剂可以分为两类：NAD类似物和非NAD类似物。NAD类似物与PARP1催化的反应底物NAD+结构类似，可竞争性结合PARP1，抑制腺苷二磷酸核糖聚合，进而阻断BER修复途径。目前临床可用的PARP1抑制剂均为NAD类似物：苯甲酰胺衍生物、苯并咪唑甲酰胺衍生物、香豆酮酰胺衍生物、2，5-二酮哌嗪衍生物、4-苯基酞嗪酮衍生物和氟酞嗪酮衍生物等〔6，15～17〕。NAD+是一种重要的辅酶，广泛存在于各代谢反应中。所以，通过抑制NAD+与PARP1反应会破坏多种细胞代谢通路，产生毒副作用。许多PARP1抑制剂临床试验颇具周折。因此，新颖的非NAD类似物得到科研人员亲睐，其靶向作用于PARP1酶本身，副作用小，可特异性抑制癌细胞增殖〔18，19〕。Thomas等〔18〕通过筛选发现了可抑制PARP1活性的非NAD类似物，临床试验显示该化合物比传统的PARP1抑制剂效果更好。这些非NAD类似物在治疗多种异种种植瘤模型中均有效，包括肾癌、前列腺癌和乳腺癌。临床前动物实验为进一步临床试验打下了坚实基础。非NAD类似物在治疗BRCA1缺陷型白血病中也取得了较好前景〔19〕。

临床上，PARP1抑制剂具有治疗BRCA突变乳腺癌和卵巢癌的潜力，不排除用于治疗前列腺癌、胰腺癌和肠癌等固体肿瘤。FDA现已批准PARP1抑制剂包括奥拉帕尼、卢卡帕尼和尼拉帕尼，维利帕尼和他拉唑帕尼也处于临床后期实验中。这些分子都是非选择性PARP1抑制剂，同时具有潜在抑制PARP2的能力。此外，PARP1抑制剂抗性也有报道。耐药机制可以分为三类：HR恢复、PARP-1表达下调和药物外排造成的细胞内PARP 浓度下降。其中，BRCA1/2二次突变、53BP1缺失和RAD51增加最终导致HR恢复〔20〕。

BRCA1/2突变导致HR缺陷，易患癌症。细胞为了增殖，倾向于RAD52蛋白介导的旁路复制叉修复通路，核酸内切酶EEPD1 介导了RAD52缺失与BRCA1/2突变产生的合成致死效应〔21〕。PARP1抑制剂临床抗性机制之一是补偿同源重组蛋白RAD51表达上调，实验证明靶向RAD51和p38的同时，联合靶向PARP1可以更好地抑制TNBC细胞增殖〔22〕。MYC基因扩增通常与RAD51表达上调相关，同时靶向MYC和PARP1同样具有抑制肿瘤生长作用〔23〕。类似地，抑制RNA解旋酶DDX3、拓扑异构酶、XRCC1或PTEN，同时抑制PARP1均可在BRCA缺陷乳腺癌中产生合成致死效应〔12，24～26〕。

2 其他合成致死研究

除了PARP1外，TNBC标志物还包括表皮生长因子受体(EGFR)、血管内皮生长因子(VEGF)、PTEN、c-Myc、C-kit和基础细胞角蛋白、p53、酪氨酸酶激酶、m-TOR和热休克蛋白〔4〕(图1)。TNBC标志物不仅可用于诊断和预后，还可基于合成致死策略开发为TNBC治疗的新靶点。

图1 TNBC信号通路(KEGG)

Horigome等〔27〕筛选突变TP53的合成致死基因，发现R248Q 突变TP53促进ADORA2B表达，敲除ADORA2B可以抑制突变TP53型 TNBC的发生和转移，提示腺苷受体途径是TNBC亚型治疗的潜在靶点。Zhu等〔5〕发现G1-S检查点异常的TNBC对TTK和CLK2激酶的抑制剂CC-671更为敏感，CC-671有望进入临床实验治疗部分TNBC患者。PTEN不仅是PI3K信号通路的抑制因子，其缺陷还可造成DNA损伤修复缺陷，抑制ATM激酶可特异性增加PTEN缺陷细胞系MDA-MB-468对铂类药物的敏感性〔28〕。联合抑制EGFR和Notch信号通路可以一定程度上降低AKT活性，导致基底样乳腺癌细胞死亡〔29〕，同时抑制EGFR和间质-上皮转化因子(MET)可下调核糖体蛋白S6抑制TNBC亚型间充质干细胞样(MSL)细胞增殖〔30〕。c-MYC一方面可以促进TNBC发生脑转移，另一方面使TNBC对肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)更为敏感，为脑转移乳腺癌治疗提供了潜在治疗策略〔31〕。Liu等〔32〕报道同时抑制c-MYC和CDK1可抑制TNBC细胞生长〔32〕。E-钙黏蛋白缺陷常见于乳腺癌中，Bajrami等〔33〕利用siRNA文库筛选发现抑制酪氨酸激酶ROS1 具有很好的抗CDH1缺陷乳腺癌的作用，为ROS1抑制剂克里唑蒂尼进入Ⅱ期临床试验提供了重要依据。

3 问题与展望

TNBC是一类难治性乳腺癌，至今缺乏靶向治疗手段。合成致死策略在TNBC“先天缺陷”的基础上，通过阻断其补救信号通路抑制肿瘤生长，诱导凋亡。因为正常细胞不存在“先天缺陷”，所以基于合成致死策略开发的治疗方法具有选择性杀伤TNBC细胞的优势。PARP1抑制剂就是基于该策略开发的治疗BRCA缺陷肿瘤的药物，但是PARP1抑制剂也具有毒副作用和耐药性，下一代PARP1抑制剂需提高靶向性和效价，克服毒副作用和耐药性。肿瘤是多突变、多信号通路异常、多阶段的异质性疾病，合成致死提示多靶点干预是有前景的治疗策略。原理上，同时干预细胞增殖、转移、代谢或凋亡的主要和代偿信号通路，都可形成合成致死效果。伴随CRISPR基因编辑文库的兴起，研究人员通过二代测序等高通量方法找到TNBC等难治性肿瘤的“弱点”，通过CRISPR文库筛选其合成致死基因，匹配已有药物库，或找到潜在的治疗靶点，为个体化精准治疗肿瘤提供了可能。