脂氧素A4抑制TLR4/NOX4/NF-κB通路减轻脓毒症大鼠脑损伤的研究

朱国辉 魏锋

脓毒症是导致危重患者死亡的重要原因，在临床上表现为感染和应激条件下的多系统并发症，其中包括脑损伤[1]。此外，脓毒症还与多种流行病学因素导致的多种免疫相关信号通路异常激活有关[2]。尽管目前对于脓毒症的研究进展迅速，但脓毒症的发病率仍然居高不下[3,4]。研究表明，机体的免疫功能紊乱是脓毒症的重要病理生理机制，包括了过度炎性反应和免疫抑制两个方面[5]。促炎细胞因子在先天免疫反应中的作用是脓毒症病理生理学领域中研究最广泛的方面之一。恶化的外周炎症可导致神经炎症，进而导致中枢神经系统的严重损伤。随后与脓毒症相关的血脑屏障破坏促进了神经胶质细胞的活化，并在中枢神经系统中引发一场促炎细胞因子风暴，导致脓毒症幸存者的脑功能障碍[6]。脓毒症的许多幸存者遭受长期认知障碍，经历过严重脓毒症住院治疗的患者出现中度至重度大脑皮层损伤的可能性是正常人的2倍多[7]。 这些慢性神经功能障碍导致致命的不良后果，然而尽管投入了大量的时间和精力，与脑损伤相关的神经系统疾病的治疗仍然缺乏成功的干预措施。Toll样受体4(TLR4)是参与信号转导的重要跨膜蛋白，可以充当微生物传感器来触发炎症和免疫反应，当其与配体结合时，TLR4可诱导下游多种信号途径[8]。NADPH氧化酶4(NOX4)是内源性ROS产生的主要来源，越来越多的研究表明TLR4和NOX4的结合对于ROS的产生至关重要[9]。NF-κB是一种广泛分布的转录因子，可以控制许多生物过程，包括炎性反应和细胞凋亡，在神经炎症中发挥重要作用[10]。脂氧素A4(LXA4)是花生四烯酸的生物活性产物，已被证明具有很强的抗炎活性。有研究证明LXA4能降低脓毒症大鼠血清白细胞介素-6和肿瘤坏死因子-α水平，减轻炎性反应，该作用可能通过抑制TLR4信号通路实现[11]。本研究探讨脂氧素A4脓毒症大鼠脑组织损伤中的作用，以及该保护作用与TLR4/NOX4/NF-κB通路之间的关系。

1 材料与方法

1.1 动物模型的建立和样品的采集与处理 清洁级SD大鼠(购自天津医科大学，动物合格证号：110322210100605613)32只，体重约280 g，12周龄，术前禁食12 h。经腹腔注射5%戊巴比妥1 mg/kg麻醉。对腹部进行常规消毒，并做一个约2 cm的切口。在腹腔中发现盲肠后，将远端盲肠和大肠之间的肠系膜分离并将盲肠远端结扎1/2，用针在中间穿刺，然后将盲肠放回腹腔，缝合腹部。正常对照组(S组)，不做结扎和穿刺外，其余步骤皆相同。脂氧素A4组(LXA4组)和TLR4激动剂组(Pam组)按照该步骤建造盲肠结扎穿孔模型后，都进行脂氧素A4 50 μg/kg腹腔注射，Pam组同时给予2 mg/kg的Pam3Cys腹腔注射。模型完成12 h，经腹腔注射5%戊巴比妥1 mg/kg麻醉大鼠，从下腔静脉收集血液并离心，收集血清并储存在-80℃用于检测血清生化指标。取脑组织，分别放在甲醛固定溶液中用于随后的苏木精-伊红(HE)染色试验(中国武汉博斯特)，剩余的储存在-80℃用于测量mRNA、酶活性和蛋白质表达水平。

1.2 HE染色法观察4组脑组织的病理变化 取出固定在组织固定溶液中的脑组织，用自动包埋机包埋石蜡进行石蜡切片，厚度为5 mm。接下来，将切片脱蜡和梯度脱水，最后干燥的薄片用苏木精染色20 min，用盐酸和乙醇溶液分离30 s，用曙红染色12 min，用90%乙醇分离45 s，封片晾干后在光学显微镜下观察。

1.3 酶联免疫吸附法测定炎性因子含量 血清炎性因子是脑损伤的重要指标，能够指示损伤修复的程度。酶联免疫吸附试验试剂盒和所有试剂在室温下缓冲30 min，制备标准溶液，然后孵育，加入生物素标记的抗体，孵育，洗涤。随后，根据实际情况的说明，检测所有指标的变化。最后，使用微孔板读数器读取各组炎症因子的吸光度从分算出炎性因子的含量。

1.4 脑组织髓过氧化物酶(MPO)活性的检测 为了观察中性粒细胞在脑部的浸润情况而进行MPO的活性测定。将储存在-80℃的脑组织小心地取出并放在冰上。然后，将组织加入裂解溶液并进行低温均质化，随后离心。接下来，收集上清液，用分光光度法测定大脑匀浆中的MPO活性。结果以mg表示。

1.5 各组大鼠的神经功能评分和脑组织含水量检测 在每组处死大鼠之前，根据Longa 5分评分法对神经功能进行评分,评分为6个等级：0分：正常，无神经功能缺损；1分：左侧前爪不能完全伸展，轻度神经功能缺损；2分：行走时，大 鼠向左侧(瘫痪侧)转圈，中度神经功能缺损；3分：行走时，大鼠身体向左侧(瘫痪侧)倾倒。重度神经功能缺损；4分：不能自发行走，有意识丧失；5分：死亡。将得分最高和最低的大鼠丢弃。在实验过程中，具有其他临床症状的大鼠也被丢弃，并且以随机方式对大鼠进行强化。采用干湿重法检测脑组织含水量。

1.6 qRT-PCR 检测TLR4/NOX4/NF-κB通路相关基因表达 从每组大鼠中提取脑组织匀浆，并使用Trizol(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)试剂盒提取总RNA。用紫外分光光度法和琼脂糖凝胶电泳检测核糖核酸的浓度、纯度和完整性，在符合检测标准后，根据操作说明反转录为cDNA。GAPDH引物：上游5’-GGTGGTCATATGACAAAACTTGAAGAG-3’，下游5’-CACCCTGTTGCTGTAGCCAAA-3’;TLR4引物：上游 5’-CTGAACCAGGGCATACCTGT-3’，下游5’-GAGAAGTCCATGTCCGCAAT-3’；NOX4引物：上游 5’-TGCATGGTGGTGGTATTGTTCCTC-3’，下游5’-AGCAGCAGCAGCATGTAGAAGAC-3’；NF-κB引物：上游 5’-CTGAACCAGGGCATACCTGT-3’，下游 5’-GAGAAGTCCATGTCCGCAAT-3’。按说明书的方法步骤配制反应体系，经过94℃预变性30 s；94℃变性5 s，60℃退火15 s，72℃延伸10 s，扩增45个循环。结果使用比较阈值法定量分析，计算方法为：目的基因定量拷贝数=2-ΔΔCt，ΔCt=目的基因 Ct 值-内参基因 Ct 值，ΔΔCt=ΔCt 实验组-ΔCt 对照组，对每一标本计算目的基因的拷贝数

1.7 蛋白印迹实验检测 称重冷冻脑组织样品并在冰上研磨。加入RAPA裂解液制成匀浆，在冰上裂解30 min，每10分钟震荡1次，直到组织完全溶解以释放组织蛋白。此后，将混合物离心，收集上清液。根据双喹啉酸(BCA)试剂盒的说明进行蛋白质浓度的测定的，然后计算每种蛋白质的浓度。最后加入5×上样缓冲液于100℃下变性10 min。配置12%分离胶进行蛋白质分离，并转移到聚偏二氟乙烯膜上。此后，在室温下用5%脱脂乳封闭膜1.5 h，加一抗GAPDH、TLR4、NOX4、NF-κB(1∶1 000稀释)在4℃下孵育过夜，TBST清洗后，加入HRP标记的羊抗兔二抗(1∶2 500)室温孵育1 h，加入显色液，凝胶成像系统用于显影和成像。GAPDH用于校正待测蛋白质的水平。最后，分析各个蛋白质条带的灰度值。该实验独立重复3次。

2 结果

2.1 4组大鼠脑组织病理的变化 S组神经细胞基本结构完整，边界清晰，神经元形态正常，顶膜清晰，脑组织皮质核均匀清晰；CLP组和Pam组出现异常和紊乱的神经元结构，基本结构被破坏，出现空泡；LXA4组的病理损伤程度明显减轻，基本结构相对完整，神经元形态相对正常。见图1。

图1 脑组织病理的变化 (黑色箭头标记受损神经元，HE×200)

2.2 血清TNF-α、IL-1和IL-6水平与脑组织中的MPO活性比较 与S组相比，其余3组的TNF-α、IL-1和IL-6水平和MPO活性均有升高(P<0.05)；而和CLP组相比，LXA4组的TNF-α、IL-1和IL-6水平和MPO活性均明显下降(P<0.05)；CLP组和Pam组间差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 血清TNF-α、IL-1和IL-6水平与脑组织中的MPO活性比较

2.3 4组大鼠神经功能评分和脑组织含水量比较 与S组相比，其余3组的脑功能评分和脑组织含水量均有所提高(P<0.05)；与CLP组相比，LXA4组的脑功能评分和脑组织含水量均明显降低(P<0.05)；CLP组和Pam组间差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2 大鼠神经功能评分和脑组织含水量比较

2.4 4组大鼠脑组织qRT-PCR 检测相关基因表达结果 与S组相比，其余3组的TLR4mRNA、NOX4mRNA和NF-κB mRNA 的表达水平明显上升(P<0.05)；与CLP组相比，LXA4组的TLR4mRNA、NOX4mRNA和NF-κB mRNA的表达水平明显下降(P<0.05)；CLP组和Pam组差异无统计学意义(P>0.05)。见表3。

表3 4组大鼠脑组织qRT-PCR 检测相关基因表达结果

2.5 信号通路蛋白的检测结果 与 S组相比，其余3组的TLR4、NOX4和NF-κB的表达水平显著上调(P<0.05)；与CLP组相比，LXA4组的TLR4、NOX4和NF-κB的表达水平显著下调(P<0.05)；CLP组和Pam组差异无统计学意义(P>0.05)。见图2，表4。

图2 4组大鼠脑组织TLR4、NOX4和NF-κB的表达量

表4 4组大鼠脑组织TLR4、NOX4和NF-κB的表达量

3 讨论

随着脓毒症研究的深入，脓毒症的进展逐渐变得清晰。脓毒症的临床病理过程主要包括细胞因子风暴、炎症介质增加、肠道细菌移位、内毒素血症以及凝血系统与炎症的相互作用[12-14]。脓毒症通常伴随着组织和器官的损伤，这是高死亡率的原因之一[15]。脓毒症会导致脑损伤，从而导致慢性神经功能障碍(包括大脑和认知麻痹以及其他缺陷)，对患者的预后造成严重影响[16]。然而，关于脑损伤相关神经疾病的治疗，仍然缺乏成功的干预措施。因此，迫切需要新的治疗方法，为脓毒症及其并发症的防治提供依据。本研究建立脓毒症大鼠模型，研究脂氧素A4的治疗作用及其具体作用机制。

脂氧素A4(LXA4)，是一种由花生四烯酸产生的内源性脂氧合酶衍生的类花生酸介体，它对各种细胞类型具有强大的双重抗炎和促分解作用。在脓毒症大鼠模型中，LXA4能降低血清IL-6和TNF-α水平，减轻炎性反应，并且能抑制脓毒症大鼠肝脏中TLR4和TRAF6的表达，表明LXA4的抗炎作用可能通过抑制TLR4信号通路实现[17]。多项研究表明LXA4 可抑制白细胞介导的损伤，促进单核细胞的趋化性和吞噬作用并且抑制促炎细胞因子的产生和细胞增殖，已被多个动物实验模型证明具有治疗潜力[18-20]。本实验结果显示，脓毒症组大鼠血清中TNF-α、IL-1和IL-6水平与脑组织中的MPO活性均明显上升，而给予LXA4干预治疗后，血清中TNF-α、IL-1和IL-6水平与脑组织中的MPO活性均明显下降，表明炎性反应有所减轻。由于脑损伤时可能会出现慢性神经功能障碍，包括脑性瘫痪和认知及其他缺陷，我们对大鼠的神经功能进行了评分。结果显示，脓毒症组部分大鼠不能行走，全身向对侧屈曲，同时伴随着脑水肿，正常组大鼠无异常，LXA4干预治疗组大鼠与对照组大鼠状态相似，脑水肿程度也有所减轻。HE染色结果显示，脓毒症组大鼠脑组织神经元结构异常紊乱，基本结构被破坏，LXA4干预治疗组脑组织基本结构完整，边界清晰，神经元形态正常，细胞质清晰，皮质核均匀清晰。然而，LXA4治疗的基础上同时给予TLR4激动剂剂Pam3Cys干预，结果发现，LXA4的治疗效果被中和，表明LXA4的治疗作用可能与抑制TLR4及其下游通路有关。

TLR4的激活及其下游信号通路在脓毒症致脑损伤机制中发挥了重要作用[21,22]。NOX4 是NADPH 氧化酶亚型的一种，在血脑屏障血管内皮细胞和神经元中特异性表达，在缺血或缺氧时被诱导，将氧转化为活性氧，在小鼠心脏、大脑和后肢缺血模型中显示，只有在大脑中NOX4才会导致缺血性损伤[23]。在脂多糖的刺激下，NOX4的COOH末端区域可以直接偶联 TLR4并诱导 NF-κB激活。为了进一步分析TLR4及其下游信号通路的作用，我们用qRT-PCR 检测了各组大鼠脑组织中TLR4mRNA、NOX4mRNA和NF-κB mRNA的表达量，Western blot 检测了各组大鼠脑组织中TLR4，NOX4和NF-κB蛋白的表达量。结果发现，在脓毒症组无论是TLR4mRNA、NOX4mRNA和NF-κB mRNA的表达量还是TLR4，NOX4和NF-κB蛋白的表达量都明显上升，而LXA4干预治疗组，TLR4及其下游的信号通路蛋白从转录水平和蛋白表达水平都有明显的降低，与此同时脓毒症的炎性反应和脑损伤作用也同时降低，给予TLR4激动剂剂Pam3Cys干预，TLR4及其下游信号通路被激活，炎性反应和脑损伤相较于治疗组加重。以上结果共同说明了TLR4/NOX4/NF-κB通路参与了脓毒症致脑损伤的致病过程。

综上所述，TLR4/NOX4/NF-κB通路参与了脓毒症致脑损伤的致病过程，脂氧素A4通过抑制脓毒症大鼠脑组织中TLR4/NOX4/NF-κB通路的破坏作用，从而抑制炎症因子如TNF-α、IL-1和IL-6表达活性以及脓毒症大鼠炎症的进一步发展，最终影响脓毒症诱导的脑损伤的进展。