白来航鸡干扰素刺激基因12 PCR 扩增

张淑萍 葛中东 张凯 夏宇欣 姜莉莉 樊兆斌*

（1，菏泽市食品药品检验检测研究院 274000；2，菏泽学院药学院 274715）

干扰素刺激基因（Interferon-stimulated genes，ISGs）是干扰素（IFN）下游的效应分子，IFN 作用于靶细胞表面受体后，通过一系列信号传导激活ISGs 的转录、表达[1，2]，在宿主免疫调节及抗病毒过程中发挥重要功能[3]。IFN 通过ISGs 发挥包括抗病毒、凋亡、抗增殖、抗肿瘤和免疫调节在内的多种细胞和生理功能[4]。不同的ISGs 可以针对病毒从入侵到释放的不同阶段发挥抑制作用[5]。以往针对ISGs 的研究主要集中在ISG15、Mx1、PKR 等[6-11]，对ISG12 的研究相对较少。ISG12 蛋白作为一个潜在的重要细胞因子，参与了机体的抗病毒过程。人巨细胞病毒（HCMV）、急性丙型肝炎病毒（HCV）感染后，ISG12表达水平均明显提高[12]，禽流感病毒（AIV）感染能引起鸡、鸭和小鼠体内的ISG12 mRNA 水平明显升高[13，14]。本研究通过RT-PCR 方法克隆了白来航鸡ISG12 基因，并对其编码蛋白进行生物信息学预测分析，研究结果为深入研究ISG12 编码蛋白功能及其抗病毒的分子机制提供有价值的参考资料。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

动物组织总RNA 提取试剂盒、Fast Quant cDNA 第一链合成试剂盒、2×Taq PCR Mastermix、D2000 Marker、凝胶回收试剂盒、DH5α 感受态、pGM-T 载体，质粒小提试剂盒等均购自天根生化科技有限公司；LB 培养基购自Solarbio 公司。

1.2 试验样品

白来航鸡的肝脏、脾脏组织。

1.3 引物设计

根据GenBank 已发表的原鸡ISG12 基因序列（登录号BN000223.1），利用primer premier 5.0 软件设计白来航鸡ISG12基因扩增引物ISG12-F/ISG12-R：ISG12-F:5'-ATGTCTGACCAG

AACGTCC-3'，ISG12-R：5'-GGACCGATGCTTCTTTCTA-3'，引物由华大基因有限公司合成。

1.4 ISG12 基因PCR 扩增

提取白来航鸡总RNA 并反转录为cDNA，以其为模板，用引物ISG12-F/ISG12-R 进行目的基因扩增。PCR 反应体系：cDNA 1μl，上游引物2μl，下游引物2μl，2×Taq PCR Master Mix 25μl，ddH2O 20μl，共50μl。PCR 反应程序：94℃预计变性5min，94℃变性30s，53℃退火30s，72℃延伸30s，共35 个循环；最后经72℃延伸10min 后4℃保存。

1.5 PCR 产物连接、转化及测序

将PCR 产物经胶回收试剂盒回收，16℃条件下连接pGMT 载体过夜，连接产物转化DH5α 感受态细胞，涂布LB（A+抗性）固体培养基，37℃培养过夜。挑取单个圆滑白色菌落于4ml LB（A+抗性）液体培养基，于37℃条件下180rpm 摇菌培养16h，后用质粒提取试剂盒提取质粒。经PCR 筛选阳性重组质粒，选取3 个阳性克隆送华大基因公司进行序列测定。

1.6 ISG12 编码蛋白理化特性及生物信息学分析

使用ProtParam 在线工具对ISG12 编码蛋白理化特性进行预测分析。利用Protscale、TMHMM 2.0 等在线软件分析ISG12编码氨基酸序列的疏水性、跨膜结构。采用SignalP-5.0 Server预测蛋白信号肽，利用NetPhos3.1 Server，NetOGlyc 4.0 和Net-NGlyc 1.0 进行潜在磷酸化位点及潜在O、N 糖基化位点预测。利用在线分析软件（http://Imed.med.ucm.es/Tools/antigenic.pl）进行抗原决定簇预测。

2 试验结果

2.1 ISG12 基因PCR 扩增结果

PCR 扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳，结果如图1 所示，扩增目的基因片段大小在400bp 左右，与预期结果一致。

图1 ISG12 基因PCR 电泳结果

2.2 ISG12 基因核苷酸序列分析

将白来航鸡ISG12 基因的核苷酸序列测序结果经DNA Star软件分析，结果表明，ISG12 基因编码区为324bp，共编码107个氨基酸。A（22.84%）、T（23.15%），G（27.47%）、C（26.54%），其中鸟嘌呤（G）含量最高。且（G+C）%为54.01%，提示ISG12 编码蛋白为稳定蛋白。

2.3 ISG12 编码蛋白理化特性及生物信息学分析

使用ProtParam 在线工具对ISG12 基因编码蛋白进行分析，结果显示，白来航鸡的ISG12 编码蛋白理论分子量为10.28 kD，分子化学式为C418H690N134O154S7，理论等电点（PI）为10.18，脂肪指数为41.12，不稳定系数为59.46，推测该蛋白为不稳定蛋白。经对ISG12 基因编码产物的亲/疏水性分析预测，其疏水性图谱如图2 所示，整个多肽链有3 个明显的亲水区，该氨基酸序列内超过半数为亲水性残基，整条多肽链表现为亲水性，平均亲水指数为-0.345。

图2 ISG12 编码蛋白亲/疏水性预测

利用在线跨膜区结构预测软件TMHMM2.0 进行ISG12 编码蛋白序列跨膜区分析，结果表明，该蛋白不含跨膜区，均为胞外区。对ISG12 基因信号肽进行预测结果表明，该蛋白不含信号肽。潜在磷酸化位点预测结果见图3，阈值0.5 时，ISG12 存在21 个潜在的磷酸化位点，其中包括17 个丝氨酸，分别位于肽链的第14、20、23、24、27、32、54、55、57、63、66、72、76、81、93、97 位和第99 位）和4 个苏氨酸（位于肽链的第55、61、80 位和第94 位）。利用软件NetOGlyc 4.0 和NetNGlyc 1.0 进行潜在O、N 糖基化位点预测，结果显示ISG12存在6 个潜在的O-糖基化位点，分别位于第76、81、91、93、97 位和第99 位；不存在N-糖基化修饰位点。抗原决定簇预测结果表明，ISG12 编码蛋白平均抗原倾向指数为0.9757，共含有3 个抗原决定簇区域，分别位于4～24，33～39 及78～88 位氨基酸。

图3 ISG12 编码蛋白磷酸化位点预测结果

3 讨论

天然免疫系统是宿主抵抗病毒感染的第一道防线，宿主抗病毒应答是宿主通过自身病原体模式识别受体识别病毒，诱导Ⅰ型干扰素的产生而启动。Ⅰ型干扰素通过激活JAK-STAT 信号通路，引起多种干扰素刺激基因（ISGs）的转录、表达，从而发挥抑制病毒复制、促进适应性免疫应答的功能。研究表明，ISGs 能有效靶向病毒复制周期的各个阶段，抑制其复制，从而实现抗病毒作用。ISG12 由IFN-α 诱导表达，ISG12 基因属于FAM14 家族，该家族成员为小的疏水蛋白质，成员具有保守的ISG12 基序。研究表明，禽白血病病毒J 亚群（ALV-J）感染鸡原代单核细胞衍生巨噬细胞(MDM) 后6h，ISG12 表达显著上调，然而转录在36h 后开始下调[15]。H5N1和H9N1感染DF-1 细胞后，均引起ISG12 表达上调[16]。以上提示ISG12 是一个潜在的重要细胞因子，对其进一步研究有助于进一步理解其抗病毒作用机制。本研究成功扩增了白来航鸡ISG12 基因，并对其进行了生物信息学预测分析，该结果为深入研究ISG12基因功能及其抗病毒机制提供了理论依据，为高效、安全的免疫佐剂研发提供了有价值的参考资料。