miR-423-5p调控TGF-β/Smad信号通路对肺癌脑转移模型大鼠的干预作用探究

杨成，王光学，张燕飞，管宏新，魏亮，钟春龙，李钦传

原发性肺癌是我国常见的恶性肿瘤之一，其常见的远处转移部位为脑部，常见部位为大脑半球，其次为小脑和脑干[1]。目前临床上对于肺癌脑转移的发病原因尚无统一定论，认为其与宿主的患病史、个人史、精神史、其他感染等相关[2]。近年来，肺癌脑转移的发生率和诊断率呈逐年上升的趋势，且肺癌脑转移患者预后效果差，自然生存时间仅为1～2个月[3]。肺癌脑转移患者常见的临床症状为呕吐、癫痫、发作性头痛、精神及意识障碍。临床上常将手术、化疗、放疗等综合手段用于肺癌脑转移患者的治疗中，可在一定程度上延长患者生存期，提高其生活质量[4]。微小RNA(miRNA)可由肿瘤细胞主动分泌，其表达量随着肿瘤细胞的生成、凋亡而变化，故miRNA表达量在一定程度上可代表人体内健康或疾病的信息。miRNA是真核生物体内具有良好稳定性的非编码RNA，广泛参与肿瘤细胞的增殖、分化、凋亡等生理过程，还在疾病发生、生物体发育时序、细胞分化凋亡等方面起重要作用[5]，但miR-423-5p在肺癌脑转移中的作用机制尚未研究。现探究miR-423-5p调控TGF-β/Smad信号通路对肺癌脑转移模型大鼠的干预作用，报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料 (1)动物: SPF级大鼠60只，雌雄各半，由郑州大学实验动物中心提供[动物许可证号：SYXK(豫)2020-0008)]，鼠龄3～6(4.75±1.19)个月，体质量226～257(229.43±26.19)g，将大鼠置于室温22～24℃，湿度40%～70%，自然光照、通风的无病原菌干净笼子中饲养，饮用的水和食物均经消毒处理。本实验经医院实验动物伦理委员会批准。(2)试药试剂：miR-423-5p慢病毒载体(滴度为1×108TU/ml)购于无锡莱弗思生物实验器材有限公司；酶联免疫试剂盒购于武汉纯度生物科技有限公司；TGF-β1、COl-1抗体购于上海恒斐生物科技有限公司；Smad2/3、Vimentin抗体购于武汉益普生物科技有限公司。(3)仪器设备： OLYMPUS CX23光学显微镜、Primer 5.0软件上海普赫光电科技有限公司产品。

1.2 实验方法 2019年2月—2020年1月于同济大学附属东方医院转化医学研究中心进行实验，

1.2.1 肺癌脑转移建模：在60只大鼠中随机数字表法选取15只作为空白组，其余大鼠随机分为模型组、上调组、下调组各15只，参照陈愉生等[6]肺癌脑转移模型建立方法造模，除空白组外，其余3组大鼠均经麻醉、仰卧位固定、消毒后，于胸骨左缘第二肋间旁开2 mm处进针3～5 mm，进针前调好BD针头至滞留空气0.05 ml左右，吸取肺癌细胞悬液0.1 ml(1×106个肿瘤细胞)，观察到血液喷射涌出作为进入左心室的标准，并在10 s内完成注射，注射完成后快速拔针，棉签按压进针点。参照文献[7]判断肺癌脑转移建模结果(图1)：模型组建模成功11例，上调组建模成功12例，下调组建模成功14例。

注：1、2、3轮次脑转移，病灶血供随轮次增加而增加；第4轮次脑转移灶提示脑转移模型建立成功

1.2.2 干预方法：建模成功后上调组、下调组大鼠分别尾部静脉注射miR-423-5p mimics control 10 μl、 miR-423-5p mimics 10 μl，空白组、模型组大鼠尾部静脉注射等体积生理盐水，miR-423-5p干预14 d后观察各组大鼠变化。

1.3 观察指标与方法

1.3.1 样本采集：在miR-423-5p干预后取大鼠脑组织行HE染色。抽取大鼠尾部静脉血2 ml，离心留取血清，置于-20℃冰箱待用。将大鼠胸腔打开，夹闭双侧肺门，结扎左右主支气管，在左主支气管近端刺入套针，使用4℃无菌肝素盐水15 ml分3次灌入左肺，每次盥洗2遍，回收肺泡灌洗液10～15 ml，离心待用。游离结扎处大鼠双肺，采用4%多聚甲醛固定左肺下叶组织，15% EDTA脱钙、脱水后进行石蜡包埋，制作厚约3 μm组织切片。

1.3.2 肺组织病理观察：取各组大鼠左肺下叶组织样本进行HE染色处理，在光学显微镜下观察大鼠肺组织病理变化。

1.3.3 采用RT-PCR法检测肺组织中miR-423-5p表达量：将Trizol 1 ml加至肺组织中并研磨为粉末后提取总RNA并检测其纯度和浓度，使用Takara逆转录试剂盒进行逆转录处理后，反应条件：37℃反转录60 min；85℃灭活酶5 s，95℃预变性30 s，95℃变性5 s，60℃退火20 s，40个循环，使用Primer 5.0软件对引物序列进行设计，miR-423-5p引物序列上游：5'-GGGTCTTGGAGTAGGTCATT-3'，下游：5'-CAGTGCGTGTCGTGGAG-3'；内参基因GAPDH引物序列上游：5'-AACAGCCTCAAGATCATCAGCAA-3'，下游：5'-GACTGTGGTCATGAGTCCTTCCA-3'。

1.3.4 血清CEA、SCC-Ag、CYFRA21-1和肺泡灌洗液TNF-α、IL-1β、IL-6检测：采用酶联免疫吸附法检测各组大鼠血清癌胚抗原(CEA)、鳞状细胞癌相关抗原(SCC-Ag)、细胞角蛋白19血清片段21-1(CYFRA21-1)水平，肺泡灌洗液中TNF-α、IL-1β、IL-6水平，将样本置于室温、制备样品；在反应孔上依次加入稀释好的待测样本及标准品100 μl /孔，37℃恒温孵育箱中湿育2 h；用专用洗涤液将反应板清洗3次，加入抗体工作液(1∶100稀释后)100 μl/孔，37℃恒温孵育箱中湿育45 min；反应板清洗4次，在反应孔内加入TMB溶液100 μl/孔，37℃恒温孵育箱中湿育45 min后，将终止液100 μl/孔加入反应孔内终止反应，在450 nm处读OD值；以OD值为纵坐标，以标准品为横坐标，绘制标准曲线，根据样本的OD值可在标准曲线上查出CEA、SCC-Ag、CYFRA21-1、TNF-α、IL-1β、IL-6水平。

1.3.5 TGF-β/Smad信号通路蛋白表达量检测：采用Western-blot法检测TGF-β/Smad信号通路蛋白表达量，将采集到的样本研磨加入蛋白缓冲液，提取各组细胞蛋白并使用BCA法测定浓度，制备电泳样品，上样量50 μg进行SDS-PAGE电泳，蛋白转至PVDF膜，加入脱脂奶粉封闭1 h，一抗4℃ 孵育过夜，洗膜3次(5 min/次)，二抗室温孵育1 h，洗膜3次(5 min/次)，加入发光液曝光3～4次，取重叠值。采用软件分析蛋白条带灰度值，内参蛋白为Actin。

2 结 果

2.1 各组大鼠肺组织病理变化比较 空白组大鼠肺泡结构完整，肺泡壁薄、间隔正常，未出现炎性细胞浸润、肉芽肿的形成；模型组大鼠肺泡结构损伤，部分肺泡萎陷或消失、间隔增厚，在肺泡腔和肺泡间质中出现显著的单核细胞、巨噬细胞等炎性细胞浸润；上调组大鼠肺间质存在大量的炎性细胞浸润，肺组织损伤严重，大量肺泡出现萎缩、塌陷现象；下调组大鼠肺炎性细胞浸润和肺泡结构损伤减轻，肺隔膜变薄，肺泡浸润基本恢复正常，见图2。

图2 各组大鼠肺组织病理学比较(HE染色，×400)

2.2 各组大鼠miR-423-5p表达量比较 与空白组miR-423-5p表达量(1.08±0.34)比较，模型组(2.34±0.71)升高(t/P=6.026/0.001)；与模型组比较，上调组(3.75±1.21)升高，下调组(0.64±0.19)降低(t/P=3.366/0.003、8.620/0.001)，且下调组低于上调组(t/P=9.513/0.001)。

2.3 各组大鼠血清CEA、SCC-Ag、CYFRA21-1水平比较 与空白组比较， 模型组CEA、SCC-Ag、CYFRA21-1水平均升高(t/P=10.900/0.001、10.050/0.001、8.267/0.001)；与模型组比较，上调组上述指标均升高，下调组均降低(t/P=2.992/0.008、3.521/0.002、2.694/0.014，3.443/0.002、2.416/0.024、2.279/0.032)，且下调组均低于上调组(t/P=5.936/0.001、5.819/0.001、4.833/0.001)，见表1。

表1 各组大鼠血清CEA、SCC-Ag、CYFRA21-1水平比较

2.4 各组大鼠肺泡灌洗液TNF-α、IL-1β、IL-6水平比较 与空白组比较，模型组TNF-α、IL-1β、IL-6水平均升高(t/P=6.519/0.001、8.841/0.001、10.630/0.001)；与模型组比较，上调组上述指标均升高，下调组均降低(t/P=2.277/0.033、2.822/0.010、2.727/0.034，2.622/0.015、5.369/0.001、2.433/0.023)，且下调组均低于上调组(t/P=4.465/0.001、7.416/0.001、4.114/0.001)，见表2。

表2 各组大鼠肺泡灌洗液TNF-α、IL-1β、IL-6水平比较

2.5 各组大鼠TGF-β/Smad信号通路蛋白表达量比较 与空白组比较，模型组TGF-β1、COl-1、Smad2/3、Vimentin蛋白表达量均升高(t/P=5.921/0.001、7.920/0.001、4.979/0.001、5.236/0.001)；与模型组比较，上调组以上指标均升高，下调组均降低(t/P=2.936/0.008、3.666/0.001、2.461/0.023、2.519/0.020，5.443/0.001、3.140/0.005、3.071/0.005、2.455/0.022)，且下调组均低于上调组(t/P=7.320/0.001、6.479/0.001、5.504/0.001、4.880/0.001)，见表3、图3。

图3 各组大鼠TGF-β/Smad信号通路蛋白印迹比较

表3 各组大鼠TGF-β/Smad信号通路蛋白表达量比较

3 讨 论

肺癌脑转移是临床常见而严重的疾病，其原因多为肺组织淋巴和供血丰富，癌细胞易从邻近的淋巴管或血管转移至远处器官，肺血管和椎静脉间常有吻合支，脱落的肺癌细胞可不经肺部毛细血管的过滤而直接入脑，增大其转移至脑部的几率[7-8]。miRNA是部分哺乳动物体内一类单链分子，对蛋白编码基因具有调控作用。miR-423-5p起初在心力衰竭等疾病中发现，孙丽丽等[9]研究中，miR-423-5p来源于心肌细胞，且在慢性心力衰竭患者体内水平显著升高，提示其可能参与慢性心力衰竭的发生、发展，具有较高敏感度，可作为评估病情严重程度的生物标志物，且其水平越高，提示心力衰竭进展较快。有研究显示[10]，miR-423-5p在卵巢癌中呈高表达，其原因可能为其可提高癌细胞的克隆形成率及侵袭细胞比例，促进异种移植瘤的生长。在本研究中，前期工作中发现miR-423-5p与肺癌脑转移密切相关，故深入探究下调miR-423-5p通过作用于TGF-β/Smad信号通路对肺癌脑转移模型大鼠的干预作用，可为肿瘤的早期无创性诊断开辟一条新途径。

CEA属于糖蛋白，结构复杂，可参与不同类型癌症的发病、发展过程[11]。在侯志华等[12]研究中，CEA在非小细胞肺癌伴脑转移患者体内呈高表达，但经治疗后其水平降低，与本研究结果一致。在孙杰等[13]研究中，CEA可作为肺癌的肿瘤标志物，且其水平变化与肿瘤细胞的增殖相关，肿瘤晚期其水平更高。SCC-Ag属于肿瘤相关抗原，分布于肺部肿瘤组织中，且在鳞状细胞癌中分布更为广泛。在覃远静等[14]研究中，SCC-Ag是一种肿瘤抗原，主要存在于肿瘤病灶内，在鳞状细胞癌中的诊断敏感度极高。CYFRA21-1是角蛋白家族成员之一，主要储存在复层肿瘤上皮细胞质内，在细胞癌变、凋亡或溶解后会进入血液中，导致血液中其水平升高[15]。在赵雪莲等[16]研究中，CYFRA21-1是一种具有较高敏感性、特异度的鳞癌标志物，可用于判断肺癌脑转移及监测发展过程。本研究结果显示，CEA、SCC-Ag、CYFRA21-1水平与肺癌脑转移密切相关，其原因可能为上述3个指标均为肿瘤的重要标志物，三者联合对肺癌脑转移的发生发展预测价值更高。

TGF-β/Smad信号通路在调控干细胞活性和器官形成中具有重要作用，当TGF-β信号通路各成员活性未激活时，体内会自发性发生多种癌症，这表明TGF-β定向调节干细胞对癌症形成具有不可或缺的功能[17-18]。TGF-β1在TGF家族中为最经典的转化生长因子。Smad2蛋白在浸润癌细胞、良性肿瘤细胞、癌前病变上皮细胞中呈低表达，但在结肠癌、乳腺癌等恶性肿瘤中呈高表达，且其水平随肿瘤分化程度增高而增高[19-20]。在王春刚等[21]研究中，TGF-β可通过与其受体相结合，将细胞外信号传递至细胞内，进而活化Smad2、Smad3与Smad4形成复合物移位至细胞核作为基因转录反应，调控肿瘤细胞的生物功能。有研究显示[22]，上调Vimentin的表达，肺癌细胞系的迁移能力显著增强，促进非小细胞肺癌的浸润和转移。在甘声通等[23]研究中，TGF-β信号通路可促进上皮—间质转化和血管生成，促使非小细胞肺癌侵袭转移，抑制此信号通路具有良好的临床应用前景。本结果显示，下调miR-423-5p可通过作用于TGF-β/Smad信号通路，阻断延缓肺癌脑转移的发生发展，其原因可能为下调miR-423-5p对TGF-β/Smad信号通路相关信号分子具有抑制作用，阻碍此信号通路的激活、细胞外信号传递至细胞内，抑制肿瘤细胞生物活性。

综上所述，下调miR-423-5p可能通过作用于TGF-β/Smad信号通路，下调TGF-β1、COl-1、Smad2/3、Vimentin蛋白表达量，减轻炎性反应，抑制肺癌脑转移的发生发展。

利益冲突：所有作者声明无利益冲突

作者贡献声明

杨成、魏亮：设计研究方案，实施研究过程，论文撰写；王光学、张燕飞：提出研究思路，分析试验数据，论文修改;管宏新：实施研究过程，资料搜集整理，论文撰写，统计学分析;钟春龙、李钦传：课题设计，论文审核