猪圆环病毒3型实时荧光定量PCR检测方法的建立

骆辉，阴文奇，高露茜，王雪涛，罗旭，廖果，李书伟，周远成*

（1.四川省畜牧科学研究院，畜禽生物制品四川省重点实验室，动物遗传育种四川省重点实验室，四川成都 610066；2.畜科生物工程有限公司，四川省动物生物制品工程技术研究中心，四川成都 610200）

猪圆环病毒3 型（PCV3）是一种新型圆环病毒，2016 年首次在患有猪皮炎肾病综合征（PDNS）与繁殖障碍的母猪及其流产胎儿体内被鉴定发现［1］。基因分析发现PCV3与PCV2、PCV1基因组之间的同源性较低，并且抗原蛋白Cap 之间不具有交叉保护性［2］。相关研究表明，PCV3已经在我国出现并且流行了很长一段时间［3］。PCV3 常以混合感染的形式出现，给养猪业的疾病防控带来了一定困难，因此，快速准确地诊断猪群的感染状态对于预防和控制猪圆环病毒具有十分重要的意义。目前，实时荧光定量PCR检测技术以其简便快捷、灵敏度高、特异性强等特点在临床上得到广泛应用。本研究通过设计针对PCV3 ORF2 的特异性引物，探索引物和探针最佳工作浓度，进一步确定最适反应体系及扩增条件，期望应用荧光定量PCR技术建立定量检测PCV3的方法。

1 试验材料

1.1 主要试剂及仪器设备 试剂：2×Premix Ex TaqTM、DL2000 DNA Marker，均购自宝日医生物技术（北京）有限公司；病毒基因组DNA提取试剂盒，购自康宁生命科学（吴江）有限公司。仪器：NanoDrop 2000（微量分光光度计，ThermoFisher Scientific）；实时荧光定量PCR 仪（CFX Connect Real-Time system，BIO RAD）。

1.2 相关引物及探针 参照GenBank 中发表的PCV3 基因组序列，针对猪圆环病毒ORF2 保守区域，应用生物信息软件Primer Premier 5.0 分别设计一对特异性引物和一条标记FAM 荧光报告基团的TaqMan MGB 探针，并送生工生物工程（上海）有限公司合成。引物和探针序列信息详见表1。

表1 PCV3引物及探针序列信息

2 试验方法

2.1 重组质粒标准品的制备 参照DNA 试剂盒提取说明书提取PCV3 阳性病料DNA，并以其为模板用上述PCV3 引物进行目的基因扩增，扩增产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳检测阳性目的基因，回收纯化PCR 扩增产物并克隆至pDC316 载体，连接产物转化E.ColiDH5α感受态细胞，挑取在氨苄青霉素抗性LB 平板上生长的阳性克隆，测序正确后提取质粒。使用NanoDrop 2000 测定质粒浓度，按以下公式计算拷贝数：拷贝数（拷贝/μL）＝（6.02×1023）×（质粒浓度×10-9）/（DNA 长度×660）。

2.2 引物和标记探针最佳工作浓度的确定 将浓度为10 μmol/L的引物和探针，分别用ddH2O稀释至终浓度为0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 μmol/L，以上述重组质粒标准品为模板，利用矩阵法进行荧光定量PCR 试验，筛选最适工作浓度，以获得的最小Ct值及典型的S型扩增曲线为判定依据。

2.3 酶最适添加量的确定 在引物和探针最佳工作浓度条件下，于扩增体系中依次添加4、6、8、10、12 μL 酶量，进行荧光定量PCR 试验，筛选酶最适添加量。

2.4 最佳退火延伸温度的确定 在引物和探针最佳工作浓度以及最适酶添加量条件下，退火延伸温度分别设置为55 ℃、56 ℃、57 ℃、58 ℃、59 ℃、60 ℃、61 ℃和62 ℃，进行荧光定量PCR试验，筛选最佳退火延伸温度。

2.5 标准曲线的建立 将PCV3 标准质粒进行10 倍系列稀释，选取7 个稀释度的标准品模板，以确定的最适反应体系及扩增条件进行荧光定量PCR扩增。以每反应拷贝数的对数为X轴，循环阈值（Ct 值）为Y轴作回归曲线，建立质粒拷贝浓度与循环阈值对应的定量标准曲线。

2.6 特异性、敏感性及重复性试验

2.6.1 特异性试验 提取猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒2 型、猪细小病毒、猪乙型脑炎病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒和猪伪狂犬病毒核酸，同时以PCV3 重组质粒标准品为阳性对照，按优化的反应体系和扩增条件进行荧光定量PCR 试验，另设立空白对照，验证该检测方法的特异性。

2.6.2 敏感性试验 将PCV3质粒标准品作10倍系列稀释，按照建立的PCV3 荧光定量PCR 检测方法进行试验，同时进行常规PCR 方法检测，比较两者的敏感性。

2.6.3 重复性试验 选取3个稀释度重组质粒为模板，进行荧光定量PCR检测，共检测3次且每个稀释度做3个平行试验，对Ct 值结果进行统计学分析，并计算组间及组内变异系数（CV），以验证所建立的荧光定量PCR方法的重复性。

2.7 对临床样品PCV3 的检测 应用本研究建立的荧光定量PCR 方法对2018～2020 年从四川省不同地区收集的329 份正常猪血清、56 份流产胎儿、29份精液、102份唾液拭子进行PCV3检测，通过PCV3 阳性率了解目前四川省内PCV3 的流行状况。

3 结果

3.1 最佳反应体系及扩增条件的确定 制备的PCV3 重组质粒标准品测定浓度为311.1 ng/μL，换算成拷贝数是7.87×1010拷贝/μL。以PCV3重组质粒标准品为模板进行荧光定量PCR 试验，筛选出的最佳反应体系及扩增条件结果见表2。检测PCV3 所用引物及探针的最适终浓度均为0.5 μmol/L，反应体系中酶最适添加量为12 μL，最优扩增条件为：95 ℃3 min；95 ℃10 s，60 ℃30 s，循环40次。

表2 荧光定量PCR检测方法的最佳反应体系

3.2 PCV3 标准曲线 不同稀释度PCV3 标准品（浓度为7.87×103～7.87×109拷贝/μL）的荧光定量PCR 扩增结果见图1，由此获得的标准曲线回归方程为：y＝-3.467 5x＋40.365，相关系数（R2）为0.999 6，扩增效率E为0.94（见图2）。表明所设计的引物及探针的扩增效率和结合率高，优化的反应条件适宜，可用于PCV3 核酸的定性和定量检测。

3.3 特异性、敏感性及重复性试验结果 特异性试验结果显示，除PCV3重组质粒标准品外，其余样品均未出现特异性扩增，表明本研究建立的荧光定量PCR 检测方法的特异性良好。敏感性试验结果见表3，荧光定量PCR 方法的最低检测值为7.87×101拷贝/μL，而常规PCR方法最低检测值为7.87×103拷贝/μL，表明本研究建立的PCV3 荧光定量PCR方法的敏感性优于常规PCR方法，检出率更高。重复性试验结果显示，不同浓度标准品模板的组内重复性试验变异系数为0.30%～0.81%，组间变异系数为0.39%～0.93%，可见PCV3 质粒标准品重复检测的变异系数均小于1%（表4），表明该方法的稳定性和重复性好。

图1 不同稀释度PCV3质粒标准品的荧光定量PCR扩增结果

图2 荧光定量PCR检测PCV3的标准曲线

表3 荧光定量PCR方法的敏感性试验结果

3.4 临床检测结果 使用本研究建立的荧光定量PCR 方法对329 份正常猪血清进行检测，得出PCV3阳性率为31.3%（103/329）。对56份流产胎儿、29 份精液、102 份唾液拭子进行检测，得出阳性率分别为48.21%（27/56）、44.83%（13/29）、31.37%（32/102）。该结果表明PCV3 在四川省内规模化猪场广泛存在，具有较高的流行率。

4 讨论

PCV3 作为一种新型猪圆环病毒，自2016 年在美国被发现以来，陆续在中国、巴西、韩国等地区的猪场出现，如今在全世界范围内已呈流行趋势。有学者表示PCV3 或可垂直传播，且与PMWS、PDNS、母猪繁殖障碍以及增生性坏死性间质性肺炎等疾病有关。值得注意的是，部分感染PCV3的猪只无临床感染症状［4-5］。

本研究建立的荧光定量PCR 方法，特异性强、重复性好、灵敏度高，最低检测值为7.87×101拷贝/μL，灵敏度高于李畅等［6］得出的129 拷贝数。张志等［7］建立的PCV3 荧光定量PCR 方法的组内及组间重复性试验变异系数小于3%，而本试验的变异系数均小于1%，可见本方法的重复性更好。目前PCV3 的病原学研究尚不明确，由于缺少适合PCV3繁殖的体外培养体系，对PCV3的分离培养比较困难，仅陈秋艳等［8］报道过通过PK15 细胞分离到PCV3 活毒株。后续可开展PCV3 的分离鉴定，为研究PCV3 的生物学特性、致病机制及疫苗研制等工作奠定基础。■