姜黄素类似物L50H8对SKOV3细胞增殖与凋亡的影响及其机制研究*

邱扬，陈龙飞，王晓玉，林绍强

1.江门市五邑中医院，广东 江门 529000； 2.佛山市第一人民医院，广东 佛山 528010；3.暨南大学附属第一医院，广东 广州 510630； 4.暨南大学附属第一医院，广东 广州 510630

卵巢癌术后复发及治疗失败的重要原因是癌细胞对化疗药物产生耐药性，罹患卵巢癌接受规范化治疗后仍有62%的患者出现肿瘤复发或处于疾病持续存在状态[1]。现阶段，开发对耐药癌株有效的新型药物仍是卵巢癌治疗研究中的热点。姜黄素是从姜黄、郁金等姜科姜黄属植物根茎中提取出的一种有效成分，具有多种药理活性，对胃肠道、乳腺及泌尿生殖系统等恶性肿瘤均显示出一定的抑制作用[2-3]。然而，CUR存在水溶解度低、水溶液易水解、首过消除效应明显、生物利用度偏低等不足，阻碍其临床应用[4]。L50H8是一种通过分子结构修饰获得的CUR类似物，具有更高的稳定性与生物利用度。本研究选择对顺铂及阿霉素耐药的卵巢癌细胞株SKOV3为模型，评估L50H8在体外对癌细胞增殖与凋亡的影响，并对其机制作初步探讨。

1 材料

1.1 细胞株SKOV3细胞株购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心。用RPMI1640培养基+10%胎牛血清+双抗(1×105IU·L-1青霉素+100 mg·L-1链霉素)配制成PRMI1640完全培养基，于37 ℃、5%CO2饱和湿度恒温细胞培养箱中培养，取对数生长期的细胞用于实验。

1.2 药品与试剂L50H8由温州医科大学药学院合成并纯化。RPMIl640培养基(美国GIBCO公司，批号：C22400500BT)；胎牛血清(中国杭州四季青公司，批号：11011-8615)；Annexin V-FICT/PI细胞凋亡试剂盒(美国BD公司，批号：556507)；蛋白定量检测试剂盒(南京凯基生物发展有限公司，批号：KGP902)；MTT和DMSO(德国Sigma公司，批号：M5655-1G、D5879)；兔抗人单克隆抗体Bax、Caspase8、cleaved-caspase3、AIF(apoptosis inducing factor)、GRP78(glucose regulated protein 78 kDa)、CHOP(C/EBP-homologous protein)(美国Cell Signaling Technology公司，货号分别为：2774S、4790S、9664S、5318S、3177S、5554S)；蛋白分子Marker(德国Fermentas公司，货号：26616)；ECL荧光底物(北京全式金生物技术有限公司，货号：DW101-02)。

1.3 仪器CO2恒温培养箱(Thermo Forma，美国)；免疫印迹凝胶成像仪(Eastman Kodak，美国)；倒置显微镜(重庆奥特光学，中国)；FACS Canto TMⅡ流式细胞仪(BD，美国)；酶标仪(BIO-RAD，美国)；台式高速冷冻离心机(Thermo Fisher公司，美国)；6孔培养板(Corning，美国)。

2 方法

2.1 MTT法观察L50H8对SKOV3细胞增殖的影响将细胞浓度调整为1×107·L-1，接种于96孔板，每孔100 μL，分别加入0 mol·L-1(单位“mol·L-1”以下均缩略为“M”)、0.625 μM、1.25 μM、2.5 μM、5 μM、10 μM、20 μM和40 μM的L50H8和CUR，每个浓度设3个复孔。加药后置于37 ℃、5%CO2饱和湿度的培养箱内培养24 h后，每孔加入0.5%的MTT溶液10 μL，继续培养4 h后，每孔加入Formanzan溶解液100 μL继续培养4 h，酶标仪检测570 nm波长处的吸光度(OD)值，计算细胞生长抑制率。实验重复3次，取平均值。

细胞抑制率=1-(实验组OD值-空白对照组OD值)/(阴性对照组OD值-空白对照组OD值)

2.2 Annexin V/PI双染色流式细胞法检测细胞凋亡将细胞浓度调整为2×108·L-1，经DMSO、20 μM 的CUR、2.5 μM、5 μM、10 μM的L50H8作用24 h后形成各浓度组，1 000 r·min-1离心3 min，弃上清，用PBS洗涤细胞1次，1 000 r·min-1离心3 min，弃上清，加入400 μL的染色缓冲液悬浮细胞，加入Annexin V和Propidium Iodide(PI)各5 μL混匀，室温避光染色20 min，流式细胞仪分析药物对SKOV3细胞凋亡的影响。

2.3 Western Blot法检测细胞凋亡蛋白的表达用DMSO、20 μM的CUR、2.5 μM、5 μM、10 μM的L50H8作用于细胞24 h后形成各浓度组，离心收集细胞，用预冷的0.01M PBS(pH 7.2)洗涤3次，加入去污裂解缓冲液，在冰上用超声细胞破碎机超声裂解细胞，离心收集上清蛋白液，BCA法检测蛋白浓度。各组取相同的蛋白量上样，在SDS聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳。电泳后转膜，封闭液封闭，加一抗4℃摇床孵育过夜，TBST洗去未结合的一抗。加二抗(14 000稀释)室温摇床孵育2 h。将ECL试剂盒中的A和B试剂等体积混合，滴加到Gel Logic 1500凝胶成像仪上。将 PVDF膜正面朝下，在膜上均匀浇抹ECL发光液，用保鲜膜平整铺在PVDF膜上，将胶片压在保鲜膜上，放入胶片机中，依次进行显影定影。采用Adobe Photoshop CS3软件对图像进行灰度分析。

3 结果

3.1 L50H8对SKOV3细胞增殖的影响MTT结果表明，随着浓度的升高，L50H8和CUR对细胞增殖的抑制率均逐渐上升，呈浓度依赖性，见图1。相比于CUR，L50H8对细胞的抑制率更高，从最低浓度0.625 μM至最高浓度40 μM，差异均具有统计学意义(P<0.05)。L50H8的IC50为(2.71±0.08) μM，CUR的IC50为(10.27±0.96) μM，差异有统计学意义(P<0.01)。

3.2 L50H8对SKOV3细胞凋亡的影响为了解L50H8对SKOV3细胞的杀伤作用是否与其诱导细胞凋亡相关，采用Annexin V/PI双荧光染色流式细胞法检测细胞凋亡率。结果显示，经DMSO、20 μM 的CUR、2.5 μM、5 μM、10 μM的L50H8处理后的细胞凋亡率分别为：(4.61±1.41)%，(10.06±1.68)%，(12.71±2.30)%，(25.96±2.01)%和(56.57±1.45)%，L50H8各浓度组与 DMSO 组比较，差异具有统计学意义(P<0.05)，L50H8 5 μM组、L50H8 10 μM组与CUR 20 μM组比较，差异具有统计学意义(P<0.01)。上述结果提示L50H8对SKOV3细胞有显著的凋亡诱导作用，其作用呈浓度依赖性，且强于CUR。见表1，图2。

注：L50H8与CUR各浓度组抑制率比较,*P<0.05；L50H8与CUR的24 h IC50比较,*P<0.01图1 L50H8对SKOV3细胞的抑制率曲线

注：R3：晚期凋亡细胞(Annexin V+/PI+)，R5：早期凋亡细胞(Annexin V+/PI-)，细胞凋亡率(%)=(R3+R5)/(R2+R3+R4+R5)×100%图2 L50H8对SKOV3细胞凋亡率的影响

表1 L50H8对SKOV3细胞凋亡率的影响

3.3 L50H8对SKOV3细胞凋亡调控相关蛋白表达的影响为进一步研究L50H8诱导细胞凋亡的具体其作用机制，用Western Blot法测定Bax、caspase8、cleaved-caspase3与AIF蛋白的表达。结果表明，L50H8能上调促凋亡因子Bax及AIF的表达，其效应呈浓度依赖性，但对caspase8蛋白表达无明显影响，cleaved-caspase3始终未见表达，见图3。

3.4 L50H8对SKOV3细胞内质网应激(endoplasmic reticulum stress，ERS)相关蛋白GRP78和CHOP表达的影响为了解L50H8是否能诱发ERS继而诱导癌细胞凋亡，采用Western Blot法测定ERS启动关键因子GRP78及前凋亡因子CHOP的表达，结果表明，L50H8能浓度依赖性地上调SKOV3细胞GRP78及CHOP的表达，且作用效果明显强于CUR，见图4。

注：A：Western Blot法检测Bax、caspase8、cleaved-caspase3与AIF蛋白的表达；B：与DMSO组比较，#P<0.05；与CUR 20 μM组比较，#P<0.05图3 L50H8对Bax、caspase8与AIF表达的影响

注：A：Western Blot法检测GRP78与CHOP蛋白的表达；B：与DMSO组比较，①P<0.05；与CUR 20 μM组比较，②P<0.05图4 L50H8对GRP78与CHOP表达的影响

4 讨论

近年来，CUR的抗肿瘤作用受到关注。有研究发现CUR可以通过抑制新生血管生成及细胞增殖，诱导癌细胞凋亡，下调表皮生长因子受体EGFR活性以及HER2的表达水平，下调核转录因子 NF-κB，抑制STAT3信号通路的激活，下调COX-2的表达水平，降低MMP9和iNOS的合成水平等多种途径发挥抗肿瘤作用[5]。但CUR分子是对称的双羰基结构，该结构稳定性较差。前期研究团队在保留CUR活性的基础上对其分子结构进行改造，得到一系列CUR类似物，在其中筛选出稳定性和抗肿瘤活性较佳的L50H8作进一步研究，发现L50H8对肺腺癌细胞A549具有良好的增殖抑制效应，IC50为2.83 μmol·L-1。为了解该药物对卵巢癌细胞的作用，本课题组将其作用于SKOV3细胞，发现L50H8对该细胞同样具有显著的抑制作用，且抑制活性明显优于CUR，24 h的IC50低于CUR的1/3，与其在肺腺癌细胞A549的IC50接近。

细胞凋亡是细胞程序性死亡的一种重要过程，能否诱导肿瘤细胞凋亡是抗肿瘤药物研究的重要观察项目之一。已有研究证实CUR能诱导SKOV3细胞凋亡[6]。本研究发现，作为CUR类似物的L50H8同样具有促进SKOV3细胞凋亡的作用，且其效应强于其母体CUR。线粒体途径是细胞凋亡调控的重要机制，该机制被触发时，线粒体内膜的通透性孔道开放使线粒体内膜通透性增加，细胞色素c等物质释放入胞质，触发细胞凋亡级联反应[7]。在该机制中，B细胞淋巴瘤/白血病-2(Bcl-2)蛋白家族成员发挥关键作用，正常情况下，该家族中的抗凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-xl与线粒体外膜的电压依赖性阴离子通道结合，促使线粒体基质中的质子外流以及ATP/ADP在线粒体与细胞质之间相互交换，形成正常离子通道，维持线粒体的生理功能。当线粒体凋亡机制被触发时，线粒体内外膜之间的通透性转换孔将Bcl-2家族中的促凋亡蛋白Bax集中到自身周围，使通道孔径增大，令该非选择性通道持续开放，使跨内膜的氢离子梯度消失、呼吸链解偶联，接续活化下游caspase家族成员如caspase8、caspase9、caspase3等发生级联反应，诱导细胞凋亡[8]。另外，Bax也可通过激活AIF引起核内DNA凝集并断裂，引起非典型的细胞凋亡。AIF是一种具有双重功能的黄素蛋白，主要存在于线粒体内外膜间隙中，当细胞在正常生理状态时，AIF作为线粒体氧化还原酶催化细胞色素c和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸之间的电子传递，既参与线粒体组成，又在能量代谢方面扮演重要角色；当细胞受到凋亡刺激时，AIF能在不依赖caspase凋亡因子的情况下，经蛋白酶水解形成 57 kD 的成熟AIF，释放入胞质中，经由自身的氧化还原区及亲环素A的辅助作用转位入核，引起染色体凝聚及DNA片段化，使细胞发生凋亡[9-10]。区俊文等[11]发现，CUR能使三阴乳腺癌细胞凋亡率增加，Bax、caspase9、caspase3蛋白表达增强；张启明等[12]发现，CUR能通过上调caspase8 mRNA、Bax、cleaved-caspase9及cleaved-caspase3蛋白表达水平促进视网膜母细胞瘤细胞凋亡；徐秀鹏等[13]发现，CUR能通过增加Bax mRNA和AIF mRNA的表达、活化caspase3和AIF蛋白促进肾癌细胞凋亡。本研究结果与上述研究结果有所不同，L50H8能上调SKOV3细胞Bax及AIF蛋白的表达，但对caspase8的表达无明显影响，活化凋亡效应分子cleaved-caspase3始终未见表达，提示L50H8对SKOV3细胞的凋亡诱导效应不依赖于线粒体caspase通路，主要通过上调Bax、激活AIF途径实现。与其他研究结果存在差异性的原因可能在于L50H8与其母体CUR分子结构上的差异，以及药物所针对的肿瘤细胞株不同，确切原因有待进一步探究。

ERS是继线粒体途径和死亡受体途径后发现的另一细胞凋亡途径。内质网内环境保持稳态是内质网发挥正常功能的先决条件。细胞具有保障内质网对蛋白质进行正常折叠与修饰的监督纠错机制，当错误折叠的异常蛋白质发生累积，细胞启动未折叠蛋白反应，包括加强蛋白质折叠、阻断多数蛋白质的翻译、加快异常蛋白质的降解等。若内质网功能紊乱持续，细胞最终将激活凋亡程序诱导自身凋亡。因ERS会引发内质网内折叠异常蛋白质的堆积，故与未折叠蛋白反应相关的因子增多常提示ERS的发生。GRP78是一种分子伴侣，属于热休克蛋白70家族成员，在蛋白质折叠与转运以及ERS反应中具有关键作用。在ERS中，GRP78扮演内质网稳态感受器的重要角色，当ERS发生时，GRP78表达增多并可通过3个内质网跨膜蛋白启动其下游的信号分子CHOP蛋白表达增加而诱导细胞凋亡，故GRP78是ERS启动的关键因子之一。一般认为，GRP78表达增加可作为ERS发生的分子标记物[14]。CHOP是一种特异性ERS转导因子[15]，是ERS过程中由抗凋亡向促凋亡转换的重要信号分子[16]，属于前凋亡因子，具有直接诱导细胞凋亡的活性[17]。有研究发现，CUR能通过ERS通路，上调GPR78和CHOP蛋白表达诱导肝癌[18]和肺癌[19]细胞凋亡。本研究发现，L50H8同样能使SKOV3细胞GRP78及CHOP蛋白表达增强，诱发ERS导致细胞凋亡；CUR虽然也能一定程度上调GRP78和CHOP表达，然其表达强度不及L50H8。

综上，L50H8能显著地抑制SKOV3细胞增殖、诱导细胞凋亡，其凋亡诱导效应可能通过上调Bax、激活AIF以及诱发ERS实现，但不依赖于线粒体caspase通路。