Seipin变化对6-OHDA诱导的PC12帕金森细胞模型自噬及凋亡的影响*

胡玉梅，郭冬芬，任真奎，刘颖，吴昌学 **，禹文峰,3**

(1.贵州医科大学 分子生物学重点实验室, 贵州 贵阳 550004; 2.贵州医科大学 地方病与少数民族疾病教育部重点实验室, 贵州 贵阳 550004; 3.贵州医科大学 基础医学院, 贵州 贵阳 550004)

帕金森病(parkinson disease，PD)是一种较常见的神经系统变性疾病[1]。研究认为，PD病理特征主要是由于黑质黑色素神经元变性丢失、多巴胺能神经元内的α-突触核蛋白(α-synuclein, α-syn)的异常积累、路易小体的出现以及遗传等因素，其临床表现包括运动迟缓、静止性震颤及肌强直等运动症状，长期服用药物治疗后出现疗效降低及多种不良反应，如症状波动和异动症等，且无法根治[2-4]。有研究者从深部脑刺激、基因层面、细胞移植及神经营养因子等方面研究，探索对PD的治疗方式[5]。随着生物信息学的发展，基因在疾病中的研究越来越多，基因可通过多种方式调节控制蛋白的表达、修饰等从而调控疾病的形成[6-7]。Seipin是由人类先天性全身性脂肪营养不良Ⅱ型基因(berardinelli-seip congenital lipodystrophy type 2 , BSCL2/Seipin)编码的蛋白，与人类多种疾病的发生机制尚不清楚[8-10]。近年来，Seipin的研究部分转向神经疾病，Seipin能通过过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)调节控制糖原合成激酶3β(GSK3β)从而影响神经元的生长，使神经元变性丢失；Seipin缺失后使大鼠神经元的增殖减慢、神经元减少，诱发疾病的发生[11-12]。由于Seipin在大脑中高表达，当其缺失后会引起相关功能的紊乱，引发一系列疾病[13-15]。在神经退行性疾病中，神经细胞受到外在条件胁迫发生损伤、凋亡时，引起细胞内凋亡相关蛋白Bax、Clevedcaspase-3的增加，使细胞发生非程序性死亡[16-17]；同时细胞自身会产生一系列调节反应，其中包括有细胞自噬(autophagy)这一过程[18]。细胞自噬能将一些受损蛋白或线粒体降解从而减少细胞凋亡，降低细胞的损伤程度而维持细胞内稳态[19-20]。在PD患者中也会存在一些损坏的蛋白或细胞器，自噬过程还未完全阐明，本研究利用6-羟基多巴胺氢溴酸盐(6-Hydroxydopamine hydro, 6-OHDA)刺激肾上腺嗜铬细胞瘤(pheochromocytoma, PC12)细胞构建PD细胞模型[21-22]，观察Seipin的表达变化，探讨Seipin与自噬和细胞凋亡的关系。

1 材料方法

1.1 材料

1.1.1细胞株 PC12细胞购买于上海生命科学院细胞库。

1.1.2试剂 6-OHDA(美国sigam公司)，BCA定量试剂盒(美国Thermo fish公司)，一抗二抗稀释液(上海碧云天生物技术有限公司)，β-actin(美国CST公司)、Seipin(美国abcom)，Bax(美国CST公司)，Bcl-2(美国CST公司)，Clevedcaspase-3(美国CST公司)，p-mTOR(美国CST公司)，LC3Ⅱ/Ⅰ(美国CST公司)，Beclin1(美国CST公司)。

1.2 方法

1.2.1细胞分组 正常的PC12细胞株分为正常组、加药组；Seipin敲低及其对照组的PC12细胞分为Seipin敲低对照组(KD-control)、Seipin敲低组(KD)、Seipin敲低对照加药组(KD-control+6-OHDA)、Seipin敲低加药组(KD+6-OHDA)；Seipin过表达及其对照组的PC12细胞分为Seipin过表达对照组(OE-control)、Seipin过表达组(OE)、Seipin过表达对照加药组(OE-control+6-OHDA)、Seipin过表达加药组(OE+6-OHDA)，上述敲低及过表达Seipin的PC12细胞株前期已验证。

1.2.2细胞加药处理 取出培养瓶，弃培养液，PBS洗3遍、每次5 min，加入0.25%胰酶0.3 mL消化细胞1 min；加入含10% FBS 2 mL培养基终止消化，1 000 r/min离心5 min，弃上清；培养基重悬混匀后计数，以1.0×105个/mL种入6孔板中培养，培养至细胞铺满瓶底70%～80%时更换成含6-OHDA浓度为75 μmoL的DMEM培养，18 h后做相关检测。

1.2.3Western blot 为检测自噬通路蛋白mTOR和p-mTOR，自噬相关蛋白LC3、Beclin1，凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2、Cleved-caspase-3和Seipin蛋白的变化，将6-OHDA处理好的6孔板取出，去除培养液，PBS洗3次，加入细胞裂解液，转移至1.5 mL Epp管冰上裂解30 min、间隔5 min震荡1次，4 ℃ 12 000 r/min 离心20 min；吸取上清入新的1.5 mL离心管，BCA蛋白定量试剂盒分析蛋白浓度，吸取上清加入SDS蛋白上样缓冲液，沸水浴10 min；取出放入冰上，按每孔30 μg等量上样。40 mA SDS-PAGE凝胶电泳，240 mA冰浴转膜2 h；取出1×TBST洗3遍，封闭1 h，1×TBST洗3遍；放入孵育盒加入一抗 4 ℃摇床孵育过夜后，1×TBST洗3遍、每次5 min，加入二抗(1 ∶4 000)室温孵育2 h，1×TBST洗3遍、每次5 min；化学发光仪曝光。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 帕金森细胞模型中凋亡、自噬相关蛋白及Seipin表达

2.1.1凋亡相关蛋白 Western blot检测凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax、Cleved-caspase-3表达情况，结果显示加药组相对正常组Bax/Bcl-2、Cleved-caspase-3升高，P<0.01，见图1。

注：(1)与正常组比较，P<0.01。

2.1.2自噬相关蛋白表达 Western blot检测mTOR、p-mTOR及自噬相关蛋白Beclin1、LC3表达情况，加药组相对正常组p-mTOR降低，自噬相关蛋白Beclin1、LC3增加(P<0.01)。见图2。

注：(1)与正常组比较，P<0.01。

2.1.3Seipin表达 Western blot检测Seipin表达情况，当加入6-OHDA后Seipin表达量相对正常组降低，P<0.01，见图3。

注：A为Western blot检测图，B为Seipin蛋白统计图；(1)与正常组比较，P<0.01。

2.2 Seipin敲低对帕金森细胞模型自噬和凋亡的影响

2.2.1对自噬的影响 Western blot结果显示，KD与KD-control比，p-mTOR/mTOR升高、自噬相关蛋白降低，分别加入6-OHDA处理后自噬都增强，但KD+6-OHDA自噬相关蛋白表达量低于KD-control+6-OHDA，P<0.05，见图4。

注：(1)与KD-control比较，P<0.05；(2)与KD-control+6-OHDA比较，P<0.05。

2.2.2对凋亡的影响 Western blot结果显示，加入6-OHDA处理后凋亡相关蛋白都增强，但KD+6-OHDA凋亡相关蛋白表达量高于KD-control+6-OHDA，P<0.05，见图5。

注：(1)与KD-control比较，P<0.05；(2)与KD-control+6-OHDA比较，P<0.05。

2.3 Seipin过表达对帕金森细胞模型自噬和凋亡的影响

2.3.1对自噬的影响 Western blot结果显示，OE相对OE-control比，p-mTOR/mTOR降低、自噬相关蛋白升高，分别加入6-OHDA处理后自噬都增强，但OE+6-OHDA自噬相关蛋白表达量高于OE-control+6-OHDA，P<0.05，见图6。

注：(1)与OE-control比较，P<0.05；(2)与OE-control+6-OHDA比较，P<0.05。

2.3.2对凋亡的影响 Western blot结果显示，加入6-OHDA处理后凋亡相关蛋白增强，但OE+6-OHDA凋亡相关蛋白表达量低于OE-control+6-OHDA，P<0.05，见图7。

注：(1)与OE-control比较，P<0.05；(2)与OE-control+6-OHDA比较，P<0.05。

3 讨论

帕金森是困扰许多中老年人的一种神经退行性疾病，目前主要是预防和减缓，不能完全治愈[3]。研究发现PD患者黑质含黑色素细胞数目减少，出现Lewy小体，多巴胺能神经元变性丢失，但其发病机制还未完全阐明[4]。6-OHDA具有神经毒性，常用6-OHDA诱导PC12细胞，构建PD的细胞模型进行PD研究[21-22]。采用6-OHDA刺激PC12细胞，加药组Seipin含量相对正常组明显降低；凋亡相关蛋白Bax/Bcl-2、Cleved-caspase-3增多差异有统计学意义(P<0.05)。p-mTOR/mTOR降低，自噬相关蛋白Beclin1、LC3Ⅱ/Ⅰ增加。可能是加入6-OHDA后细胞受损，凋亡蛋白增加，细胞自身代偿反应使自噬增强，以排除受损蛋白或细胞器。Seipin是先天性脂肪营养不良二型基因编码的蛋白，定位于内质网，具有调节脂滴的形成、脂肪生成影响神经疾病的作用，在大脑中高表达，Seipin除调节脂滴、脂肪组织的形成外可能对大脑有重要作用[9]。在用具有神经毒性的6-OHDA刺激PC12细胞后，加药组中凋亡增强、细胞自噬水平升高、Seipin含量降低，可能是由于加入6-OHDA后细胞受损，凋亡蛋白增加，而细胞自身代偿反应使自噬增强，排除受损蛋白或细胞器，同时Seipin下降，于是我们通过将Seipin敲低和过表达，并加入6-OHDA观察Seipin的变化及自噬和细胞凋亡的情况。发现Seipin敲低后自噬降低，Seipin过表达后自噬增加；加药后Seipin敲低加药组比Seipin敲低对照加药组自噬低，凋亡蛋白多；Seipin过表达加药组相对Seipin过表达对照加药组自噬高，凋亡蛋白减少。6-OHDA可能通过降低Seipin调节的自噬，诱导细胞发生凋亡。Seipin功能广泛，在神经疾病中可能有重要作用，但具体机制及影响需要更多研究者去研究发现。