过表达CagA对胃癌细胞中GLUT1表达的影响*

程薇，杨丽萍，周建奖，谢渊，全欣莹，陈定宇，王琴容，赵艳**

(1.贵州医科大学 地方病与少数民族性疾病教育部重点实验室 & 贵州省医学分子生物学重点实验室，贵州 贵阳 550004；2.贵州医科大学附属医院 临床医学研究中心，贵州 贵阳 550004)

胃癌是全球范围内最常见的恶性肿瘤之一，亦是症死亡的第3大原因[1]。近年来，虽然胃癌诊断和治疗方面取得了进展，但是5年生存率仍然低于30%，即使手术切除的胃癌患者也有50%～90%的复发和转移风险[2]。胃癌的发病机制较复杂，至今尚不明确，主要影响因素有幽门螺杆菌(Helicobacterpylori，H.pylori)感染、肿瘤微环境及基因表达失调，而H.pylori感染是重要的始发因素[3-5]。有研究表明，H.pylori长期感染会引发急性胃炎、慢性萎缩性胃炎、胃溃疡和胃黏膜相关淋巴组织淋巴瘤等胃部疾病，与胃癌的发生发展密切相关[6]。H.pylori细胞毒素相关基因A蛋白(cytotoxin associated gene A，CagA)是一种高免疫原性蛋白，分子量为120～140 kDa。细菌通过cagA毒力岛编码的IV型分泌系统(type IV secretion system, TFSS)将CagA转移到宿主细胞中，能与宿主细胞激酶相互作用，并参与酪氨酸磷酸化修饰[7]；CagA也可以直接以未磷酸化状态发挥作用，从而影响细胞紧密连接、细胞极性、细胞增殖和分化、炎症反应的诱导以及信号传递[8]。肿瘤细胞代谢异常，即使在有氧条件下也偏好糖酵解，称为Warburg效应[9]。肿瘤细胞Warburg效应通常表现为生长迅速，摄取高水平的葡萄糖、谷氨酰胺，糖酵解增强、丙酮酸和乳酸堆积，这些与癌症的发生及预后不良密切相关[10]。偏好有氧糖酵解能为肿瘤细胞提供生存优势，但其机制并不完全清楚。有文献提示其主要影响因素有代谢酶改变、能量代谢改变、线粒体功能损伤、氨基酸代谢异常、基因失调、肿瘤微环境等[11]。研究证明，在肝癌细胞糖酵解途径中，葡萄糖转运蛋白GLUT1的表达明显上调[12]。本实验建立过表达glut1稳转AGS和BGD823胃癌细胞株，并用过表达cagA的腺病毒感染2株稳定转染细胞株，用免疫荧光检测过表达cagA对GLUT1表达的影响和细胞定位，为后续研究CagA引起胃癌细胞能量变化奠定实验基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1细胞、质粒 胃癌细胞AGS购于ATCC公司(美国)，BGC-823购于中国科学院上海细胞库，人原代胃癌细胞YHD由课题组前期分离保存。过表达CagA腺病毒载体由课题组构建和保存。glut1慢病毒载体pCDH-CMV-GLUT1-EF1-turboRFP-T2A-Puro及相应的空载体购于上海柯雷达生物技术公司，慢病毒的包装由公司完成。

1.1.2主要试剂和仪器 DMEM高糖培养基、澳洲胎牛血清、磷酸盐缓冲液(PBS)、青霉素/链霉素(10 000 U/mL)购于美国Gibco公司，二甲基亚砜(DMSO)、0.25% EDTA胰蛋白酶溶液购于美国Sigma公司，CagA和GLUT1抗体购于美国Cell Signaling Technology公司，内参GAPDH、β-actin抗体，羊抗兔、羊抗鼠辣根过氧化物标记二抗，羊抗兔、羊抗鼠荧光二抗均购于美国Proteintech公司，Triton X-100(中国索莱宝公司)，SDS-PAGE蛋白电泳凝胶试剂盒(中国碧云天生物公司)。CO2恒温培养箱购自Thermo Fisher公司(美国)，生物安全柜购于Esco公司(新加披)，Obesever A1型倒置显微镜购于蔡司公司(德国)，LSM 710激光共聚焦显微镜购于蔡司公司(德国)，-80 ℃ 超低温冰箱购于海尔公司(中国)，DYY-4C型电泳仪电源购于北京六一生物技术有限公司(中国)，Mini-Sub cell GT水平电泳槽、Mini-PROTEAN Tetra垂直电泳槽购于Bio-Rad(美国)，高速台式离心机、低速台式离心机购于Thermo Fisher Scientific(美国)。

1.2 方法

1.2.1过表达glut1慢病毒感染胃癌细胞株AGS、BGC823并筛选稳转细胞株 取对数生长期的原代胃癌细胞，以1×106个/孔的细胞量接种于6孔板，细胞汇合度至70%～80%，将3 μg过表达glut1质粒和5 μL Lipofectamine 2000分别与200 μL Opti-MEM培养基混匀，室温静置5 min。将质粒溶液加入Lipofectamine 2000溶液中，移液枪轻柔吹打混匀，室温静置20 min；每孔的培养基更换成0.6 mL不含FBS、双抗的DMEM高糖培养基，再将转染复合物均匀滴加到相应的实验孔中、混匀，放于37 ℃ 5% CO2培养箱培养；转染6 h后更换成新鲜的DMEM高糖完全培养基。24～48 h后，加入嘌呤霉素，终浓度0.002 mg/L，筛选稳转细胞株，以空载体慢病毒感染的AGS和BGC823细胞为对照。

1.2.2Western blot检测CagA、GLUT1的蛋白表达 转膜前预先使用甲醇活化PVDF 膜，根据目的蛋白分子量大小设定电压和时间，转膜结束，用5% 脱脂奶粉封闭膜2 h，加入相应的一抗溶液(稀释比例均为1 ∶1 000)，置于水平摇床，4 ℃ 孵育过夜。取出PVDF膜，TBST洗膜3次、10 min/次，加入HRP标记的羊抗兔二抗(1 ∶10 000)室温孵育2 h；TBST洗PVDF膜3次、10 min/次；将PVDF膜平整放入化学发光仪，均匀滴加超敏 ECL化学发光试剂，曝光。

1.2.3免疫印迹和免疫荧光鉴定AGS/glut1、BGC-823/glut1稳转细胞株 培养AGS、BGC-823、BGC-823/glut1、AGS/glut1细胞，按照1×106个/孔将细胞接种于15 mm玻底直径的激光共聚焦皿，用腺病毒以MOI 50感染细胞48 h；出共聚焦皿，PBS缓冲液洗1次，4%多聚甲醛室温固定15 min后用PBS缓冲液洗3次、5 min/次；加入0.3% Triton X-100，室温孵育5～20 min；PBS缓冲液洗/3次、5 min/次，山羊血清室温封闭1 h，弃掉封闭液，滴加500 μL稀释好的一抗溶液(1 ∶200)，放入4 ℃ 冰箱孵育过夜。第二天PBS缓冲液洗共聚焦皿3次、5 min/次，滴加500 μL稀释好的荧光二抗溶液(1 ∶200)，室温避光孵育1 h。PBS缓冲液洗3次、5 min/次，滴加500 μL DAPI溶液，室温避光孵育5～10 min，PBS缓冲液洗3次、5 min/次。弃掉皿中溶液，加入200 μL PBS缓冲液，使用LSM 710激光共聚焦显微镜采图。

2 结果

2.1 过表达CagA降低AGS和人原代胃癌细胞中GLUT1的表达

分别用空载体腺病毒(NC)和pAdeno-cagA腺病毒感染AGS和人原代胃癌细胞YHD 72 h后，免疫荧光检测GLUT1蛋白的表达。结果发现GLUT1蛋白主要在细胞膜上表达，且过表达CagA能引起细胞膜上GLUT1蛋白的表达降低并出现碎片化(图1)。

注：过表达CagA的AGS、YHD胃癌细胞免疫荧光鉴定，其中NC为空载组，CagA为过表达CagA组。

2.2 免疫印迹和免疫荧光鉴定AGS/glut1、BGC-823/glut1稳转细胞株

为了探讨CagA引起GLUT1表达降低的原因，过表达glut1慢病毒感染胃癌细胞株AGS和BGC823，用嘌呤霉素筛选稳转细胞株，Western blot检测稳转细胞株中GLUT1的表达。结果显示成功构建过表达GLUT1的AGS和BGC-823 稳转细胞株(图2A)，分别命名为AGS/glut1和BGC-823/glut1。随后选取BGC-823细胞用免疫荧光检测GLUT1蛋白表达，进一步证实BGC-823/glut1细胞膜上高表达GLUT1(图2B)。

注：A示BGC-823/glut1、AGS/glut1细胞Western blot鉴定，其中MOCK为空白组，pCDH-NC为空载组；B示BGC-823/glut1细胞免疫荧光鉴定(标尺40 μm)，其中NC为空载组，pCDH-glut1为过表达GLUT1组。

2.3 GLUT1和CagA在细胞膜上共定位

成功构建过表达GLUT1的稳转细胞株以后，用pAdeno-cagA腺病毒感染BGC-823/glut1和AGS/glut1稳转细胞株，72 h后免疫荧光检测发现GLUT1蛋白和CagA均在细胞膜上表达，在细胞膜上共定位(图3)，提示CagA可能引起细胞膜的破坏。

图3 CagA与GLUT1在BGC-823/glut1及AGS/glut1细胞上的共定位结果(免疫荧光，标尺50 μm)

3 讨论

胃癌是起源于胃黏膜上皮的恶性肿瘤。H.pylori感染可导致急、慢性胃炎、消化性溃疡、胃癌的发生[13]。CagA是H.pylori重要毒力因子之一，是哺乳动物中发现的首个细菌性致癌蛋白，亦被称为细菌癌蛋白[14]。近年来，虽然对H.pylori进行了大量的研究，但是迄今为止H.pylori-CagA对细胞能量代谢的机制并不清楚。因此，本研究用过表达CagA腺病毒感染人胃癌细胞株AGS和人原代胃癌细胞YHD，免疫荧光检测发现过表达CagA能够抑制细胞膜上GLUT1蛋白的表达，并且破坏细胞膜使GLUT1蛋白的表达呈现碎片。GLUT是细胞糖代谢过程中的首个关键蛋白，作为水溶性物质的葡萄糖需要借助GLUT通过细胞磷脂双分子层转运进入细胞质。GLUT有14个成员，与葡萄糖有高的亲和力的是GLUT1，GLUT3和GLUT4，可以高效率地转运葡萄糖[15]。研究表明，在恶性肿瘤细胞中，常特征性地过表达GLUT1或GLUT3[16]。在卵巢癌和肺癌细胞中，缺氧可诱导氟代脱氧葡萄糖2摄入增加，GLUT1蛋白表达上调[17]。

有研究发现H.pylori感染胃上皮细胞后，将CagA注入细胞内，与细胞膜内磷脂酰丝氨酸结合，定位在细胞膜的浆膜面，引起细胞形态变化，这可能与胃上皮异常增生和肿瘤恶性程度相关[18]。本研究中，用免疫荧光共定位检测发现CagA和GLUT1共定位于细胞膜上，推测两者的共定位是CagA破坏细胞膜，引起GLUT1表达碎片化的直接原因。但是，这些结果与上述肿瘤细胞中葡萄糖摄取增加的结果不一致，提示CagA可能通过其它的机制引起胃癌的发生发展。

综上，本研究首次证实CagA与GLUT1共定位于细胞膜上，破坏细胞膜，抑制GLUT1蛋白的表达。该研究将为进一步研究CagA对细胞的毒性以及致病致癌机制奠定基础。