槲皮素通过调控高尔基应激对脂多糖诱导小鼠副鼻窦炎的影响机制*

卢志宾，王旭燕，田素景，朱建光，白云冬，高跃

(陆军第82集团军医院 眼耳鼻喉科，河北 保定 071000)

副鼻窦炎亦称鼻窦炎，是目前耳鼻咽喉科中常见的一种多发病，亦是鼻咽癌患者经过放疗后出现的一种较为常见的并发症[1-3]。副鼻窦炎是由多种因素共同作用引起的疾病，其中细菌感染是公认的一项重要病因[4-6]，主要有革兰阴性菌和阳性菌的混合共存[7-9]。脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)是革兰阴性菌的细胞壁成分，是导致发病的关键因子。LPS可与跨膜受体toll样受体4(toll-like receptor 4，TLR4)结合，进而将外源信号传至细胞内。LPS在免疫系统中具有双重的影响，一方面LPS能促进机体整体或局部的免疫系统抵制细菌感染；而当感染严重时，大量的LPS与机体单核巨噬细胞作用，产生大量炎症因子致使炎症反应失控，出现感染性休克或器官衰竭的现象[9]。槲皮素是黄酮类化合物中较为典型的一种，具有显著的抗氧化性强的特点，属于分布范围最广、也是人类饮食中含量最多的一种生物类黄酮[10]。槲皮素具有抗菌消炎、抗肿瘤、保肝护肝等功效，具有较强的针对革兰阴性菌的抗菌效果，可用于预防各种细菌性感染类的疾病[11-12]。为了探究鼻窦炎的治疗方法，本研究通过研究槲皮素对LPS诱导的小鼠副鼻窦炎的影响，进而探究槲皮素改善小鼠副鼻窦炎的作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1实验动物 选取30只清洁级昆明小鼠，雄性，体质量(20±2)g，无鼻腔或上呼吸道疾病，购自复旦大学动物实验室。

1.1.2试剂和仪器 氯胺酮(江苏恒瑞医药股份有限公司，国药准字S20060104)，LPS(湖南一格制药有限公司，国药准字S43020003)，槲皮素(中国药品生物制品检定所，批号100081-200406)。超净台(BIOBASE博科超净台)，4%多聚甲醛(上海碧云天公司)，HE染色法试剂盒(上海碧云天公司)，光镜显微镜(徕卡显微系统，德国Leica公司)。大鼠抗小鼠高尔基体蛋白GM130单克隆抗体(美国Sigma公司)，大鼠抗小鼠高尔基体蛋白GOLPH3单克隆抗体(美国Sigma公司)，大鼠抗小鼠半胱氨酸蛋白酶单克隆抗体(美国Sigma公司)。组织蛋白裂解液(上海碧云天公司)，BCA法试剂盒(上海碧云天公司)，双向电泳2-DE系统(北京六一生物科技有限公司)，PVDF膜(美国Sigma公司)，肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)ELISA试剂盒(上海碧云天公司)及白介素-6(interleukin-6，IL-6)ELISA试剂盒(上海碧云天公司)。

1.2 方法

1.2.1实验分组与建模 将45只小鼠随机均分为正常组、模型组和治疗组，模型组和治疗组小鼠构建副鼻窦炎模型，通过肌肉注射150 mg/kg的氯胺酮使其麻醉，使用1 mL注射器吸取1 mg/L的LPS 0.1 mL，通过鼻腔滴入法将LPS滴入小鼠鼻腔内；对照组滴生理盐水。造模后治疗组每天通过灌胃法给予100 mg/kg的槲皮素，对照组和模型组给予生理盐水。

1.2.2鼻窦黏膜组织的病理学检测 造模两周后，断头处死法处死小鼠，取出小鼠鼻黏膜组织，置于4%多聚甲醛中固定，鼻窦黏膜进行HE切片制作。光镜下观察实验小鼠的鼻黏膜改变，进行鼻黏膜组织病理评分评分标准：A黏膜上皮(0～3分)、B增生(0～3分)、C腺体增生(0～3分)、D炎性浸润(0～3分)、E 变性坏死(0～3分)、F 淋巴样组织增生、鼻黏膜组织病理指数=B+3(A+D)+C+E+F，评分越高、病理改变越重。

1.2.3免疫印迹(Western blot)法检测高尔基体蛋白GM130、高尔基体蛋白GOLPH3和半胱氨酸蛋白酶(cysteine protease，Caspase3)表达 小鼠鼻窦黏膜组织研磨成粉末状后，加组织蛋白裂解液处理30min，获取组织蛋白，BCA法检测蛋白含量；电泳、转膜，大鼠抗小鼠高尔基体蛋白GM130单克隆抗体、大鼠抗小鼠高尔基体蛋白GOLPH3单克隆抗体、大鼠抗小鼠半胱氨酸蛋白酶单克隆抗体孵育，漂洗和显影，测定高尔基体蛋白GM130、GOLPH3和Caspase3表达。

1.2.4酶联免疫吸附测定(ELISA)法检测TNF-α和IL-6含量 小鼠鼻黏膜组织，研磨成粉末状后，按照TNF-α和IL-6 ELISA试剂盒说明书测定TNF-α和IL-6含量。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 一般状态

实验各组小鼠在造模前均可正常饮食、饮水、活动自如，精神状态良好，毛发光泽、无掉毛或脱毛、无鼻涕、无喷嚏等症状。造模后，正常组小鼠一般情况与造模前相似；模型组小鼠出现流涕、挠鼻、打喷嚏等现象，1周后达到高峰；治疗组造模后出现挠鼻、流涕的现象，但抓鼻、挠鼻和流涕的现象较模型组少。

2.2 病理学改变

正常组小鼠的鼻腔和鼻窦黏膜组织的结构规则，无明显的炎症细胞浸润，仅含有少量杯状细胞；而模型组和治疗组小鼠鼻窦黏膜下层有纤维组织增生、浆细胞浸润、上皮细胞脱落、坏死，上皮细胞分布不均等现象；且模型组较治疗组的现象更严重(图1)。

注：A为鼻窦黏膜组织，B为鼻腔黏膜组织。

2.3 病理指数评分

与正常组比较，模型组小鼠鼻窦黏膜的病理指数评分升高，差异有统计学意义(P<0.05)。与模型组比较，治疗组小鼠鼻窦黏膜的病理指数评分降低，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 各组小鼠鼻窦黏膜病理指数评分

2.4 GM130、GOLPH3和Caspase3表达

与正常组比较，模型组小鼠鼻黏膜组织中GOLPH3和Caspase3表达增加，GM130蛋白表达减少，差异有统计学意义(P<0.05)；与模型组比较，治疗组GOLPH3和Caspase3表达减少，GM130表达增加，差异有统计学意义(P<0.05)。见图2和表2。

图2 各组小鼠高尔基体蛋白GM130、GOLPH3和Caspase3的表达

表2 各组小鼠鼻窦黏膜高尔基体蛋白GM130、GOLPH3和Caspase3的表达

2.5 TNF-α、IL-6

与正常组比较，治疗组小鼠鼻窦黏膜组织内炎性因子TNF-α和IL-6含量相对升高，差异有统计学意义(P<0.05)。与模型组比较，治疗组小鼠鼻窦黏膜组织内炎性因子TNF-α和IL-6含量相对减少，差异有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表3 槲皮素对鼻窦炎小鼠鼻窦黏膜TNF-α和IL-6含量的影响

3 讨论

鼻窦炎是宿主和其周围环境因素等相互作用的结果，每年因鼻窦炎治疗的费用接近60亿美元，给患者的家庭也带来了沉重的经济负担[13]。随着鼻内镜外科技术的不断发展，鼻窦炎治疗困境得到了一定缓解作用，但仍存在术后复发、转移等现象。本研究发现，采用LPS诱导形成的副鼻窦炎小鼠模型经过槲皮素治疗后，其病理形态学较模型组较为接近正常健康小鼠，病理指数评分较低，且小鼠的鼻黏膜内高尔基蛋白GOLPH3和Caspase3表达减少，而GM130蛋白表达增加，同时炎症因子TNF-α和IL-6含量减少。高尔基体属于一个动态结构，可不断的与其他细胞器进行脂质和蛋白质的交流[14]。GOLPH3属于高尔基体来源的一种应激相关蛋白，主要位于高尔基体的外膜处，该蛋白的表达水平和机体细胞内的氧化应激水平之间存在着正相关[15]。该基因是对于高尔基体的结构及其顺行转运等方面存在着重要影响。GM130属于高尔基体中一种顺式基质蛋白，可用于维持带状形态特征结构。当GM130磷酸化后便与P115结合能力降低，是造成高尔基复合物裂解的主要原因之一。在对糖尿病性心肌病的研究中发现，外源性精胺能够通过降低GM130表达，增加caspase 3和GOLPH 3表达，用于抑制高尔基体应激，达到减轻高糖诱导的小鼠心肌损伤的效果。因此，GOLPH3和GM130是高尔基应激反应中重要的参与者[16]。

上呼吸道炎症性疾病的发病因素较为复杂，其发病过程中具有多种炎性细胞、免疫细胞和细胞因子的参与[17]。Dellacono等[18]研究发现，在慢性炎症鼻黏膜组织中具有白介素-4(interleukin-4，IL-4)和干扰素γ(interferon-γ，IFN-γ)的表达，且该两种因子比例和患者鼻黏膜内Th2/Th1炎症反应类型存在相关性。在用LPS刺激细胞6 h后发现，0～100 mg/L的LPS可刺激IFN-γ分泌增加，当其在0～20 mg/L时，可刺激IL-4分泌增加[19]。因此认为高浓度的LPS刺激可导致毒性损伤增强。在对慢性鼻窦炎患者的研究中发现，当长期给予患者低剂量的大环内酯类药物进行治疗时，其治疗效果良好，可有效降低机体内炎症因子水平[20]。在早期的鼻窦炎发病因素的研究中，临床上大部分主张用抗生素作为治疗鼻窦炎的主要药物，证实炎性反应和鼻窦炎之间具有相关性。

槲皮素被认为是一种常见的黄酮醇类物质，当其被人体消化吸收后，形成结合型物质，主要以硫酸化、甲基化和葡萄糖磷酸化的形式存在[21]。在对槲皮素和其代谢物的研究中发现，生理浓度为2 μmol/L和10 μmol/L的槲皮素可有效抑制机体内细胞间黏附分子-1(intercellular cell adhesion molecule-1，VCAM-1)和细胞间黏附分子-1(intercellular cell adhesion molecule-1，ICAM-1)及单核细胞趋化蛋白1(monocyte chemotactic protein 1，MCP-1)趋化因子的表达，其中槲皮素的主代谢物对这些炎症因子的抑制作用低于槲皮素[22]。有研究认为，槲皮素对人中性粒细胞无明显的保护作用。但在LPS诱导小鼠PAW264.7巨噬细胞的研究中发现，槲皮素可有效抑制由LPS刺激引起的IL-1、TNF-α和IL-6等因子的转录和蛋白的合成[23]。槲皮素代谢物对于内皮细胞具有有效的保护作用。槲皮素作为一种抗菌因子可有效降低机体内的炎症反应，减少炎性因子的分泌[24]。中药中所含的槲皮素对革兰阴性菌的抑菌功效比革兰阳性菌强，其中表现在对3种真菌的强抑制性。因此，槲皮素作为广谱类的抗菌物质，可用于治疗细菌感染性疾病。槲皮素对于LPS引发的机体炎症反应和免疫应答具有显著抑制作用。槲皮素的作用机制可能通过核因子KB(nuclear factor-kB，NF-kB)活化后，抑制细胞内ICAM-1因子的表达达到治疗作用。LPS刺激后，经槲皮素治疗可有效抑制其黏附分子CD11b/CD18和CD62L的表达，降低LPS诱导炎症反应的活化效应，从而减少炎症细胞浸润。

综上所述，槲皮素可通过调节高尔基应激抑制由LPS诱导的小鼠鼻窦炎的炎症反应，达到改善小鼠鼻窦炎症状的作用。