过表达Seipin对大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞凋亡的影响*

胡玉梅，任真奎,3，郭冬芬，刘颖，吴昌学 **，禹文峰 **

(1.贵州医科大学 分子生物学重点实验室, 贵州 贵阳 550004; 2.贵州医科大学 地方病与少数民族疾病教育部重点实验室, 贵州 贵阳 550004; 3.黔西南州人民医院 检验科, 贵州 兴义 562400)

Seipin(berardinelli-seip congenital lipodystrophy type 2,BSCL2/Seipin)是由人类先天性全身性脂肪营养不良Ⅱ型基因编码的非酶蛋白，于1954年首次被发现[1]，定位于内质网内的非酶蛋白，高表达于大脑，睾丸及全身脂肪细胞，在调节脂滴的形成、脂肪生成、脂滴稳态以及细胞甘油三酯脂解过程中都起重要作用[2-4]。在肾相关疾病研究中发现，Seipin缺失时会发生肾脂质积聚和出现蛋白尿、产生胰岛素抵抗、并调节睾丸磷脂稳态[5]。研究发现，BSCL2/Seipin在阿尔茨海默病、帕金森(parkinson disease，PD)、脑卒中等疾病中都有重要作用[6-8]，Seipin在PD患者中表达降低[9-10]；在敲除神经细胞Seipin的小鼠中，小鼠神经元增殖能力减弱、运动协调方面表现出年龄相关的缺陷，进一步引起α-突触核蛋白的聚集磷酸化等现象[11-12]。有研究发现Seipin在中枢神经系统中高度表达、运动相关神经核内亦存在Seipin 阳性神经元，推测Seipin可能对PD的形成或发展有重要作用[13]。在PD细胞实验过程中，常用大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞(Pheochromocytoma , PC12)构建PD细胞模型[14-15]，本研究通过构建Seipin高表达PC12细胞，观察Seipin对PC12细胞凋亡的影响，并为下一步对PD病研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1细胞及仪器 PC12细胞(购于中国上海生命科学院细胞库)，BG-power600电泳仪(BAYGENE)、CSU-W1激光共聚焦显微镜(YOKOGAWA)、1730R冷冻高速离心机(GENESPEED)、ECO实时荧光定量PCR仪(广东仪涛科学仪器有限公司)。

1.1.2实验试剂 DMEM培养基(美国gibco公司)、胎牛血清(美国gibco公司)、过表达慢病毒pHS-AVC-LW1760(北京合生基因科技有限公司)、阴性对照慢病毒pHS-BVC-LW346(北京合生基因科技有限公司)、逆转录试剂盒(TAKARA)、FastStart Universal SYBR Green Master(ROX，罗氏)、SDS快速凝胶试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司)、一抗二抗稀释液(上海碧云天生物技术有限公司)、Seipin(美国Abcom)、Bax(absin)、TUNEL细胞凋亡检测试剂盒(YEASEN)。

1.2 方法

1.2.1细胞培养 将PC12细胞用PBS清洗3次、加入0.25%胰酶0.5 mL消化细胞，1 min后加入2 mL完全培养基(含1%的双抗和10%胎牛血清的DMEM)终止消化；将培养基吸取吹打培养瓶底部使细胞完全脱落，吸取细胞悬液入新的15 mL离心管，1 000 r/min离心5 min；弃上清，2 mL完全培养基重悬细胞，加入培养瓶中37 ℃、5% CO2培养箱中培养。

1.2.2构建Seipin过表达PC12细胞 将PC12细胞以3.0×104个每孔种入12孔板中，分为正常PC12细胞组(正常组)、阴性对照病毒pHS-BVC-LW346感染组(阴性组)和pHS-AVC-LW1760感染组(Seipin过表达组)，加入对应的慢病毒，同时加入助感染试剂，培养24 h荧光拍照，并将培养液换为含有10%FBS的DMEM培养基继续培养，转染慢病毒质粒带有红色荧光和嘌呤霉素抗性筛选基因：细胞密度适当时候换为加含有嘌呤霉素的培养基筛选具有抗性的细胞。

1.2.3Real time PCR检测BSCL2 mRNA表达水平 取出处理好的细胞，PBS洗3遍，采用TRIZOL一步法提取RNA，TAKARA逆转录试剂盒将RNA逆转为cDNA，作为Real time PCR模板进行下一步或-80 ℃保存。每个样品取1个200 μL的薄壁管，加入SYBR Green 5 μL、双蒸水3 μL、上下游引物0.5 μL、模板cDNA 1 μL配制成1 0μL体系，加入PCR板，上机检测。

1.2.4Western blot检测凋亡相关蛋白BCL2-Associate X蛋白(Bax)的表达 取出分组处理好的细胞，弃培养液，用4 ℃预冷PBS洗3次。加入适量细胞裂解液，将裂解的细胞悬液转入1.5 mL Epp管，置于冰上裂解30 min，该期间每5 min剧烈振荡15～30 s，12 000 r/min 4 ℃离心10 min。马上将上清吸取至预冷的EPP管中。配制标准品，将样品进行蛋白定量，根据蛋白定量结果，SDS蛋白上样缓冲液混合沸水浴10 min，上样电泳，30 mA SDS-PAGE凝胶电泳，冰浴转膜、240 mA恒流2 h。转膜结束后取出PVDF膜，TBST漂洗3次，封闭1 h后TBST漂洗3次，一抗4 ℃孵育过夜、TBST漂洗3次，二抗室温孵育2 h，TBST漂洗3次进行化学发光曝光仪曝光，曝光得到图片用Image J计算目的蛋白和相应内参的灰度值进行统计分析。

1.2.5TUNEL试剂盒染色检测细胞内断裂DNA情况 向12孔中板内放入20 mm的细胞爬片，将1.0×105个细胞种入12孔板内，培养24 h、弃培养液，4%多聚甲醛室温固定细胞20 min。PBS洗2遍每次5 min，加入0.5%的Triton-100通透，孵育20 min，PBS洗2遍每次5 min。阳性对照做预先处理：加入1×DNase I Buffer 100 μL，孵育5 min后加入每100 μL含有1 U DNA酶I的1×DNase I Buffer 100 μL、孵育10 min，去离子水洗3遍。所有样本滴加1×Equilibration Buffer 100 μL，室温下孵育20 min。配制TdT孵育缓冲液，即 ddH2O 34 μL、5×Equilibration Buffer 10 μL、Alexa Fluor 488-12-dUTP Labeling Mix 5 μL、TdT(阴性对照换为双蒸水)1 μL，将爬片上 1×Equilibration Buffer吸水纸吸除，加入TdT孵育缓冲液50 μL，放入湿盒37 ℃避光孵育1 h。取出PBS洗2遍，加入DAPI封片，Confocal拍照。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 荧光鉴定

通过慢病毒感染PC12细胞，慢病毒质粒带有RFP荧光，细胞感染24 h后便可观察是否出现红色荧光，初步鉴定感染是否成功，图1显示：正常组未加慢病毒感染，不能观察到红色荧光，慢病毒载体感染的细胞阴性组、过表达组均出现红色荧光，感染效率在80%以上。

图1 慢病毒感染后荧光结果(标尺200 μm)

2.2 BSCL2 mRNA表达

通过提取正常组PC12细胞、感染后经嘌呤霉素筛选后的阴性组和Seipin过表达组细胞mRNA做定量分析，Seipin过表达组BSCL2 mRNA水平相较正常组和阴性组明显升高，差异有统计学意义(P<0.05)。见图2。

注：(1)与正常组和阴性组比较，P<0.01。

2.3 Seipin及Bax蛋白表达

Western blot结果显示，通过与正常组和阴性组相比，过表达组Seipin蛋白表达量明显升高；且凋亡相关蛋白Bax降低，差异有统计学意义(P<0.01)。见图3。

注：A为Western blot蛋白条带图，B为Bax条带灰度值统计图，C为Seipin条带灰度值统计图；(1)与正常组和阴性组比较，P<0.05。

2.4 细胞核内DNA断裂情况

TUNEL试剂盒检测细胞凋亡晚期过程中细胞核DNA断裂情况，将断裂的DNA标记上绿色荧光，结果显示Seipin过表达组细胞核荧光强度相比正常组和阴性组较弱。见图4。

图4 TUNEL凋亡试剂盒检测PC12细胞凋亡(标尺20 μm)

3 讨论

Seipin是人类先天性脂肪营养不良2型基因编码的蛋白，其高表达于大脑、睾丸、全身脂肪细胞，并定位于内质网，是一个有重要的蛋白，目前研究主要围绕脂质代谢、神经、肾研究[16-18]。Seipin在大脑中高表达，有研究发现Seipin与神经疾病密切相关，且Karin等[9-10]对病理确诊的PD患者和年龄和性别匹配的正常人死后蓝斑核组织进行蛋白质组分析，发现Seipin在PD患者中表达量下调，于是本研究通过构建Seipin高表达组，观察Seipin表达量增高后对细胞凋亡的作用。通过慢病毒感染将带有红色荧光蛋白的Seipin过表达载体导入PC12细胞，荧光显微镜观察到红色荧光，初步判断载体导入细胞内。通过Real time PCR定量BSCL2 mRNA相对水平，Seipin过表达组内BSCL2 mRNA明显升高。Western blot检测Seipin蛋白的表达水平，Seipin过表达组Seipin蛋白水平明显高于正常组和阴性组。Western blot检测凋亡相关蛋白Bax的表达水平，过表达组中Bax较正常组和阴性组降低，差异有统计学意义；经TUNEL染色观察到相对正常组和阴性对照组，过表达组细胞核内断裂DNA染成绿色的荧光较弱，进一步判断Seipin过表达后可能对细胞有一定的保护作用。

综上所述，本研究成功构建过表达的PC12细胞，发现在Seipin表达量高的情况该细胞株的凋亡相关蛋白Bax及断裂DNA减少，提示Seipin可能对细胞有保护作用，但具体机制需要进一步进行研究。