黄芩素通过Nrf2/NF-κB/NFATc1信号通路对牙周病大鼠破骨细胞形成和牙槽骨吸收的影响▲

毕 磊 刘 辉 武 燃

(华北理工大学附属医院口腔正畸修复科，河北省唐山市 063000，电子邮箱：bilei18631575530@163.com)

牙周病是由细菌感染引起的一种慢性炎性疾病，可导致牙龈发炎、牙槽骨损伤，牙周炎患者常出现牙龈出血、袋囊炎等症状[1-2]。牙周病引起机体成骨形成与破骨吸收失衡，过多的骨吸收与牙槽骨损伤密切相关[3]。破骨细胞主要发挥骨吸收作用，其分化由多种因子共同调控[4]。核因子κB(nuclear factor kappaB，NF-κB)与其配体结合可活化活化T细胞核因子c1(nuclear factor of activated T-cells，cytoplasmic 1，NFATc1)，参与调控破骨细胞的分化[5]。此外，牙周组织中炎性细胞因子、趋化因子的产生以及氧化应激反应可加剧牙周病的发生[6]。核因子E2相关因子2(nuclear factor E2-related factor 2，Nrf2)是机体抗氧化应激的主要调控因子，在氧化应激、炎症、凋亡等过程中发挥重要作用[7]。Nrf2通过抑制NF-κB核转位，上调抗氧化酶的表达，降低细胞内的活性氧水平，从而抑制破骨细胞的分化[8]。黄芩素是黄芩属草本植物的主要活性成分，具有抗氧化、抗炎、抗微生物及免疫调节等生物学功能[9]。研究表明，黄芩素可以通过调节Nrf2信号通路，减少牙槽骨丢失[10]。但关于黄芩素对牙周病患者破骨细胞的影响的研究较少。故本研究探讨黄芩素对牙周病大鼠破骨细胞形成牙槽骨吸收的影响，并探讨其可能作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 无特定病原体级雄性SD大鼠40只，6～8周龄，体重180～210 g，由本院实验动物中心提供。实验动物生产许可证号：SCXK 2018-0004；实验动物使用许可证号：SYXK 2018-0051；动物质量合格证号：19061708。

1.2 主要试剂及仪器 黄芩素(批号：MB6699)购自美仑生物科技有限公司；白细胞介素(interleukin，IL)-1β酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)试剂盒(批号：ml063132)、IL-6 ELISA试剂盒(批号：ml063159)、肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)ELISA试剂盒(批号：ml002095)均购自上海酶联生物科技公司；活性氧初级绿色荧光测定试剂盒(批号：HL100164)购自上海哈灵生物科技有限公司；谷胱甘肽ELISA试剂盒(批号：BC1175)、丙二醛ELISA试剂盒(批号：BC0025)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)ELISA试剂盒(批号：BC0175)、抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate-resistant acid phosphatase，TRAP)检测试剂盒(批号：G1492)均购自北京索莱宝科技有限公司；兔多克隆Nrf2抗体(批号：ab92946)、兔多克隆NF-κB抗体(批号：ab7549)、兔单克隆甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)抗体(批号：ab181602)购自英国Abcam公司；鼠单克隆NFATc1抗体(批号：sc-7294)购自美国Santa Cruz公司；辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔二抗(批号：BHR101)购自北京博尔西科技有限公司；酶联免疫分析仪(型号：EVO75)购自澳大利亚Techan公司；超低温冰箱(型号：MDF-U32V)购自美国Thermo公司；手术器械(型号：11231-220-230)购自北京友诚嘉业生物科技有限公司；生物显微镜(型号：Eclipse E200)购自日本尼康公司；凝胶成像系统(型号：GelDoc EZ)购自美国伯乐公司。

1.3 实验方法

1.3.1 分组牙周病大鼠模型的构建：将SD雄性大鼠按随机数字表法分为对照组、模型组、黄芩素低剂量组、黄芩素高剂量组，每组10只。除对照组外，其他组制备牙周病大鼠模型。用10%水合氯醛(0.3 mL/100 g)腹腔注射麻醉大鼠，麻醉剂量为0.2 mL/100 g；用4.0丝线伸入龈沟，结扎大鼠上颌右侧第二磨牙，采用眼科细剪割破牙龈，划入龈沟1 mm深[11]。造模1周后，观察大鼠牙周情况，如存在牙龈处红肿、探诊出血、深牙周袋形成则确认牙周炎模型构建成功。分别在黄芩素低剂量组、黄芩素高剂量组大鼠上颌右侧第一和第二磨牙间腭侧、颊侧的龈沟底注入黄芩素，剂量分别为2.5 mg/(kg·d)、5.0 mg/(kg·d)，1次/d，在对照组与模型组大鼠相同位置注入等量生理盐水，均连续给药7 d。

1.3.2 标本采集：末次给药后禁食12 h，取各组大鼠尾静脉血4 mL，静置后室温下3 500 r/min离心10 min，留取血清，-80℃储存备用。用10%水合氯醛(0.3 mL/100 g)腹腔注射麻醉处死大鼠，分离右侧磨牙区段颌骨并用4%多聚甲醛固定备用；取牙周组织，剪取约0.5 g储存在-80℃冰箱中备用，剩余牙周组织置于4%多聚甲醛中固定，做常规石蜡切片，备用。

1.3.3 影像学检测大鼠牙槽骨吸收情况：取1.3.2中用4%多聚甲醛固定的磨牙区段颌骨，进行三维CT拍摄，测量釉牙骨质界至牙槽嵴顶(cementum-enamel junction to alveolar bone crest，CEJ-ABC)的距离，测量3次后取均值代表牙槽骨吸收度。

1.3.4 苏木精-伊红染色法观察大鼠牙周组织病理变化：取1.3.2中制备的牙周组织切片，脱蜡至水化，苏木精染色、伊红染液复染，不同梯度乙醇脱水，透明，封片，镜下观察牙周组织病理变化。

1.3.5 TRAP染色法计数大鼠牙周组织破骨细胞：将1.3.2中制备的牙周组织切片常规脱蜡水化，然后按照TRAP检测试剂盒说明书步骤进行染色，吹干后，用中性明胶封片，显微镜下观察并进行破骨细胞计数。将细胞核为蓝色、细胞质为红色的细胞判定为破骨细胞，镜下随机选取5个视野(200倍)，计数破骨细胞个数，取平均数。

1.3.6 检测大鼠血清IL-1β、IL-6、TNF-α、丙二醛、谷胱甘肽水平及活性氧、SOD活性：取1.3.2中保存的血清，采用ELISA法检测血清IL-1β、IL-6、TNF-α、丙二醛、谷胱甘肽水平及SOD活性，采用活性氧初级绿色荧光测定试剂盒检测活性氧活性，具体操作步骤均参考其说明书。

1.3.7 蛋白质印迹法检测大鼠牙周组织Nrf2、NF-κB、NFATc1蛋白表达水平：取牙周组织，加入含蛋白酶抑制剂的RIPA组织裂解液，研磨后，12 000 r/min离心30 min，留取上清液，采用二喹啉甲酸法检测蛋白浓度；调整上样蛋白至50 μg，进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，转膜、加一抗(兔多克隆Nrf2抗体、兔多克隆NF-κB抗体、鼠单克隆NFATc1抗体、兔单克隆GAPDH抗体的稀释比例均为1 ∶1 000)，4℃孵育过夜；次日加辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔二抗(1 ∶3 000)室温孵育2 h，TBST洗膜，加电化学发光液，采用Bio-Rad成像系统检测蛋白灰度，采用Image J软件定量分析Nrf2、NF-κB、NFATc1蛋白表达水平。目的蛋白相对表达水平=目的蛋白条带灰度值/内参(GAPDH)蛋白条带灰度值。

1.4 统计学分析 采用SPSS 22.0软件进行统计学分析。计量资料以 (x±s)表示，多组间比较方差齐时行单因素方差分析，两两比较采用SNK-q检验，方差不齐时采用秩和检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 4组大鼠牙槽骨吸收情况 与对照组相比，模型组、黄芩素低剂量组、黄芩素高剂量组大鼠牙槽骨吸收度升高(均P<0.05)；模型组、黄芩素低剂量组、黄芩素高剂量组大鼠牙槽骨吸收度依次降低(均P<0.05)。见图1及表1。

图1 4组大鼠牙槽骨吸收情况三维CT图像

表1 4组大鼠牙槽骨吸收度的比较(x±s ，mm)

2.2 4组大鼠牙周组织病理学变化 对照组大鼠牙周组织无明显病理变化，表现为纤维排列整齐，无炎症细胞浸润；模型组大鼠牙周组织上皮增生，胶原纤维排列紊乱，有大量炎症细胞浸润；黄芩素低剂量组、黄芩素高剂量组大鼠牙周组织炎症细胞浸润较模型组明显减少。见图2。

图2 4组大鼠牙周组织病理变化(苏木精-伊红染色，标尺=50 μm，×200)

2.3 4组大鼠牙周组织破骨细胞数量的比较 与对照组相比，模型组、黄芩素低剂量组、黄芩素高剂量组大鼠牙周组织破骨细胞数增多(均P<0.05)；模型组相、黄芩素低剂量组、黄芩素高剂量组大鼠牙周组织破骨细胞数依次减少(均P<0.05)。见图3及表2。

图3 4组大鼠牙周组织破骨细胞镜下图像(TRAP染色，标尺=50 μm，×200)

表2 4组大鼠牙周组织破骨细胞数量的比较(x±s，个)

2.4 4组大鼠血清炎症因子水平的比较 与对照组相比，模型组、黄芩素低剂量组、黄芩素高剂量组大鼠血清炎症因子IL-1β、TNF-α水平升高(均P<0.05);模型组、黄芩素低剂量组大鼠血清IL-6水平均高于对照组与黄芩素高剂量组(均P<0.05)，而对照组与黄芩素高剂量组血清IL-6水平差异无统计学意义(P>0.05)；模型组、黄芩素低剂量组、黄芩素高剂量组大鼠血清炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α水平依次降低(均P<0.05)。见表3。

表3 4组大鼠血清炎症因子水平的比较(x±s，pg/mg)

2.5 4组大鼠血清氧化应激因子及谷胱甘肽、丙二醛水平的比较 与对照组相比，模型组、黄芩素低剂量组、黄芩素高剂量组大鼠血清谷胱甘肽水平、SOD活性降低，活性氧活性升高，模型组、黄芩素低剂量组大鼠血清丙二醛水平升高(均P<0.05)；模型组、黄芩素低剂量组、黄芩素高剂量组大鼠血清SOD活性依次升高，丙二醛水平、活性氧活性依次降低(均P<0.05)，黄芩素低剂量组、黄芩素高剂量组大鼠血清谷胱甘肽水平均高于模型组(均P<0.05)，而黄芩素低剂量组与黄芩素高剂量组的谷胱水平差异无统计学意义(P>0.05)。见表4。

表4 4组大鼠血清氧化应激因子及谷胱甘肽、丙二醛水平的比较(x±s)

2.6 4组大鼠牙周组织Nrf2、NF-κB、NFATc1蛋白表达水平的比较 与对照组相比，模型组、黄芩素低剂量组、黄芩素高剂量组大鼠牙周组织Nrf2蛋白表达水平降低，NF-κB、NFATc1蛋白表达水平升高(均P<0.05)；模型组、黄芩素低剂量组、黄芩素高剂量组大鼠牙周组织Nrf2蛋白表达水平依次升高，NF-κB、NFATc1蛋白表达水平依次降低(均P<0.05)。见图4及表5。

图4 4组大鼠牙周组织Nrf2/NF-κB/NFATc1信号通路相关蛋白相对表达水平

表5 4组大鼠牙周组织Nrf2、NF-κB、NFATc1蛋白相对表达水平的比较(x±s)

3 讨 论

牙周病是常见的口腔疾病，是导致患者牙齿丧失的主要原因，严重影响人们的身体健康和生活质量。牙槽骨吸收是牙周病的主要病理特征，本研究结果显示，与对照组相比，模型组大鼠牙周组织上皮增生，胶原纤维排列紊乱，有大量炎症细胞浸润，模型组、黄芩素低剂量组、黄芩素高剂量组大鼠牙槽骨吸收度升高(P<0.05)，这与胡芳等[12]的研究结果相似。以上结果提示牙周病大鼠模型构建成功。黄芩素是从唇形科植物黄芩中提取的一种黄酮类化合物，具有抗炎、抗肿瘤、抗病毒等作用[13]。本研究结果显示，与模型组相比，黄芩素低剂量组、黄芩素高剂量组大鼠牙周组织炎症细胞浸润明显减少，且以上3组的牙槽骨吸收度依次降低(P<0.05)，提示黄芩素可以降低牙槽骨吸收度，减轻牙周病症状，且呈剂量依赖性。

破骨细胞是一种多核巨细胞，与骨吸收过程密切相关，在牙周炎、骨质疏松症等多种溶骨性疾病的发生和发展过程中具有至关重要的作用[14]。NFATc1可介导破骨细胞分化，在破骨细胞生长过程中发挥作用，研究显示牙周炎小鼠体内NFATc1表达水平升高，破骨细胞增多[15]。本研究结果显示，与对照组相比，模型组、黄芩素低剂量组、黄芩素高剂量组大鼠牙周组织破骨细胞数增多，NFATc1蛋白表达水平升高(P<0.05)，提示破骨细胞及NFATc1与牙周病的发生密切相关。付方胜等[16]的研究显示，黄芩素可以抑制破骨细胞分化。本研究结果也显示，模型组、黄芩素低剂量组、黄芩素高剂量组大鼠牙周组织破骨细胞数依次减少，NFATc1蛋白表达水平依次降低(P<0.05)，提示黄芩素可以降低牙周组组织中NFATc1蛋白表达水平，并有效抑制牙周组织中破骨细胞的产生。在病理条件下，活化的免疫细胞分泌的多种促炎细胞因子有助于破骨细胞的分化和活化[3]。本研究结果显示，与对照组相比，模型组、黄芩素低剂量组、黄芩素高剂量组大鼠血清炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α水平升高(P<0.05)，这与Yu等[17]的研究结果相似，提示牙周病大鼠体内炎性因子分泌增加，引起机体炎症反应。Li等[18]的研究显示，黄芩素可以有效降低牙龈上皮细胞IL-1β、IL-6表达水平，有显著抗炎作用。本研究结果也显示，模型组、黄芩素低剂量组、黄芩素高剂量组大鼠血清炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α水平依次降低(P<0.05)，提示黄芩素可以减少炎性因子的分泌，减轻炎症反应。由此推测黄芩素可以通过抑制炎症因子分泌，从而减少破骨细胞生成，进而减少牙槽骨吸收。

机体内氧化应激与牙周炎的发生和发展密切相关，在牙周炎病中内源性氧化应激水平增加[19]。活性氧的产生和抗氧化系统之间的平衡在牙周健康中起着重要作用，机体中活性氧过量会引起氧化应激[20]，谷胱甘肽、SOD、丙二醛共同参与机体的氧化反应，是评价氧化应激的常用指标。本研究结果显示，与对照组相比，模型组、黄芩素低剂量组、黄芩素高剂量组大鼠血清氧化应激因子谷胱甘肽水平、SOD活性降低，活性氧活性升高，模型组、黄芩素低剂量组大鼠血清丙二醛水平升高(P<0.05)，提示牙周病引起机体氧化应激反应。而模型组、黄芩素低剂量组、黄芩素高剂量组大鼠血清氧化应激因子谷胱甘肽水平、SOD活性依次升高，丙二醛水平、活性氧活性依次降低(P<0.05)，提示黄芩素可以减轻牙周病大鼠的氧化应激反应。

Nrf2是机体抗氧化系统的主要调控因子，通过与编码基因启动子区域中的抗氧化反应元件结合，其不仅可以上调SOD、血红素加氧酶-1等解毒基因和抗氧化剂的表达，还可以抑制细胞因子、炎症趋化因子、细胞黏附因子等促炎因子的表达[21-22]。NF-κB介导TNF-α、IL-6、IL-8等细胞因子和趋化因子产生，在控制炎症损伤中起关键作用[23]。Qi等[24]的研究显示，激活Nrf2信号通路可以抑制NF-κB活化，从而减轻人牙龈成纤维细胞的炎症反应。本研究结果显示，与对照组相比，模型组、黄芩素低剂量组、黄芩素高剂量组大鼠牙周组织Nrf2蛋白表达水平降低，NF-κB蛋白表达水平升高(P<0.05)，提示牙周病的发生与Nrf2、NF-κB相关；而模型组、黄芩素低剂量组、黄芩素高剂量组大鼠牙周组织Nrf2蛋白表达水平依次升高，NF-κB蛋白表达水平依次降低(P<0.05)，提示黄芩素可能通过调控Nrf2/NF-κB信号通路相关蛋白的表达以抑制炎性因子分泌，从而减少破骨细胞增加，降低牙槽骨吸收度。

综上所述，黄芩素可能通过调节Nrf2/NF-κB/NFATc1信号通路，抑制机体炎症反应、氧化应激反应，从而减少破骨细胞增加，进而降低牙槽骨吸收度，有效缓解牙周病症状。但其具体作用机制仍需进一步研究。