常规体外受精中异常来源冻融单囊胚移植的妊娠结局和新生儿结局▲

张 卉 柴亮听 卢 静 王常燕 常文亮

(1 河北省邯郸市中心医院生殖医学科，邯郸市 056000，电子邮箱：huihui12302@163.com；2 河北省邯郸市第一医院检验科，邯郸市 056000)

在体外受精-胚胎移植过程中，正常受精是通过在受精后16～18 h观察到清晰的两个原核(two pronuclei,2PN)来确认。然而，在实际临床工作中有时会发现无原核(non-pronucleus,0PN)或单原核(single pronucleus,1PN)的合子，两者的发生率分别为11.3%～20.0%[1]和1.6%～7.7%[2]。此类胚胎可能是未受精或异常受精的卵子，由于其存在染色体异常的风险，欧洲人类生殖与胚胎学学会指南并不建议移植这些胚胎[3]。研究表明，部分0PN和1PN来源的胚胎为二倍体胚胎，具有正常的染色体结构，有可能发育为类似2PN的正常胚胎[4-6]。目前，囊胚培养作为胚胎优选的方法之一，已经在生殖中心广泛应用。已有报道表明，移植0PN和1PN来源的卵裂期胚胎有较高的流产率和较低的妊娠率，但移植囊胚期胚胎能够得到与2PN来源囊胚类似的临床妊娠结局[7-9]。虽然有关0PN及1PN胚胎移植后妊娠结局的研究报道很多，但关于健康婴儿出生和新生儿随访的文献报道并不多。本文回顾性分析常规体外受精(conventionalinvitrofertilization，c-IVF)中0PN和1PN来源冻融单囊胚移植的妊娠结局及新生儿情况，为了解0PN和1PN来源胚胎的临床应用效果、提高胚胎利用率、制定临床移植策略提供参考。

1 资料和方法

1.1 临床资料 回顾性分析2015年12月至2019年6月于邯郸市中心医院生殖医学科实施冻融单囊胚移植的255例不孕症患者的临床资料。纳入标准：c-IVF周期中有0PN、1PN和2PN来源囊胚，且冷冻解冻后囊胚存活并移植的患者。排除标准：接受卵胞浆内单精子注射(intracytoplasmic sperm injection，ICSI)治疗、卵裂期胚胎移植及移植后失访的患者。每对夫妇在充分了解0PN和1PN胚胎在体外受精-胚胎移植过程中相关的潜在问题后，签署书面知情同意书。

1.2 实验室策略 采用本中心常规长方案、短方案进行控制性卵巢刺激[10]，当3个卵泡直径≥18 mm时，给予肌肉注射人绒毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin,hCG)5 000～10 000 IU(珠海丽珠制药)，35～37 h后经阴道B超引导下取卵并用c-IVF方式受精。取卵当日，男方手淫取精，使用梯度离心法和上游法处理精子，按照6～8个卵、10万～20万条精子/mL的比例在双井皿中进行受精。在6% CO2、5% O2和89% N2的环境中进行胚胎培养。加入精子16～18 h后，在倒置显微镜下观察卵子原核和极体，确认受精情况。观察受精卵，存在2个明显不同的原核和2个极体的合子为2PN，只有1个原核和两个极体的合子为1PN，没有原核和存在2个极体的合子为0PN。第3天可利用胚胎定义为细胞数≥6个、细胞碎片比例≤25%的2PN胚胎。除外第3天移植及冷冻的2PN胚胎，将剩余2PN胚胎及所有1PN和0PN卵裂期胚胎进行囊胚培养。参照Gardner等[11]提出的囊胚分级系统，根据囊胚腔扩张程度、内细胞团和滋养层细胞质量对囊胚进行评分；本中心可利用囊胚的定义为扩张度≥3期且内细胞团和滋养层细胞至少一项优于C级的囊胚。

1.3 胚胎冷冻保存及冻融囊胚移植 本研究选用c-IVF后第5天或第6天的可利用囊胚进行冷冻保存，0PN、1PN、2PN来源囊胚的冷冻标准均相同。通过玻璃化冷冻的方法进行冷冻和解冻，按照玻璃化冷冻、解冻试剂盒(日本Kitazato公司，冷冻液、解冻液批号分别为：VT101、VT102)操作说明书进行操作。所有囊胚解冻后立刻接受激光削除1/4周透明带辅助孵化，见图1。3组患者采用自然周期或人工周期准备子宫内膜：(1)自然周期。于患者月经周期第8～10天采用经阴道B超监测卵泡及内膜，当卵泡直径>14 mm时，注意监测黄体生成素、雌二醇、孕酮水平，排卵后第5天行冻融单囊胚移植。(2)人工周期。月经第3天起口服戊酸雌二醇(补佳乐，德国拜耳公司)，第3～6天为2 mg/次，2次/d；第7～11天为3 mg/次，2次/d；之后根据内膜厚度调整用药剂量及时间。当内膜厚度达到8 mm及以上、雌二醇>200 pg/mL时，肌肉注射黄体酮(浙江仙琚制药)，第1～2天为40 mg/d，1次/d；第3～6天为60 mg/d，1次/d，并于第6天行冻融单囊胚移植。当进行胚胎移植时，不论胚胎级别如何，均优先考虑移植2PN来源囊胚，在患者充分知情同意后，可将1PN和0PN囊胚移植入无2PN胚胎的患者子宫内，最终分别有27例、19例、209例患者移植0PN、1PN、2PN胚胎，分别记为0PN组、1PN组和2PN组。移植后继续给予黄体支持，使用黄体酮60 μg/d肌肉注射或黄体酮凝胶(瑞士默克雪兰诺公司)90 mg/d阴道给药，直至移植14 d后检测血β-hCG。

图1 冻融囊胚透明带示意图(×20)

1.4 妊娠结局和新生儿结局的评估 (1)妊娠结局：记录3组患者的着床率、临床妊娠率、持续妊娠率、早期流产率、异位妊娠率。患者移植后14 d查血β-hCG水平，β-hCG≥3 mU/mL为阳性，28 d行B超检查，有孕囊者为临床妊娠，异位妊娠亦记为临床妊娠；早期流产为孕12周内的自然流产；持续妊娠为宫内妊娠持续超过12周。(2)新生儿结局：参与调查的夫妇在妊娠的每个阶段均进行电话随访。记录3组患者活产率以及新生儿出生时孕周、出生时体重、性别、先天畸形的情况，其中新生儿先天畸形定义为起源于胚胎期和胎儿期的发育异常。

1.5 统计学分析 采用SPSS 21.0软件进行统计学分析。计量资料以(x±s)或M(Q)表示，组间比较采用完全随机设计资料的方差分析或非参数检验；计数资料以例数或率表示，组间比较采用χ2检验或Fisher确切概率法检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 3组患者基础资料的比较 3组患者均行单囊胚移植。3组患者的年龄、不孕年限、体质指数、移植前内膜厚度及内膜方案比较，差异均无统计学意义(均P>0.05)。见表1。

表1 3组患者基础资料的比较

2.2 3组患者妊娠结局和新生儿结局的比较 1PN组的胚胎着床率、临床妊娠率、持续妊娠率均低于其他两组，但差异均无统计学意义(均P>0.05)；2PN、1PN组的早期流产率较0PN组高，其中1PN组最高，但差异均无统计学意义(P>0.05)；2PN组患者临床妊娠中有2例为异位妊娠，均为左侧输卵管间质部妊娠，3组的异位妊娠率差异亦无统计学意义(P>0.05)。1PN组的活产率均低于其他两组，但差异均无统计学意义(均P>0.05)；其中2PN组有1例孕20+2周因羊水过少使用缩宫素自然分娩后胎儿死亡，98名活婴儿出生中1名出生7 d后因不明原因腹泻住院，治疗无效死亡。3组的新生儿出生时孕周、出生时体重和性别构成比差异均无统计学意义(均P>0.05)，3组均无先天畸形婴儿出生。见表2。

表2 3组患者妊娠结局和新生儿结局的比较

组别n活产胎儿数活产率新生儿出生时孕周(x±s,周)新生儿出生时体重(x±s,g)男性/女性(n)重大先天畸形儿(n)0PN组271348.15%(13/27)38.65±2.423 071.31±556.695/801PN组19526.32%(5/19)38.12±1.903 518.00±455.213/202PN组2099846.89%(98/209)38.54±1.693 374.18±566.9852/460 F/χ2值—3.0590.1701.908——P值—0.2170.8440.1530.608*—

3 讨 论

原核形成是受精成功的标准，出现2PN是正常受精的标志。但在辅助生殖技术中，还可以观察到多原核(≥3PN)、1PN或者0PN的异常受精情况。一般认为，此类胚胎不适合进行移植。但临床研究显示，0PN和1PN来源的胚胎中也存在正常受精的胚胎，这些胚胎染色体正常，能够发育为形态正常的胚胎[9，12]。有研究表明，在没有2PN来源胚胎时，可以考虑移植0PN、1PN来源囊胚，可获得与2PN囊胚相似的妊娠结局[13-14]。而多原核常见于多精受精，此类胚胎有染色体多倍体的风险，目前不建议继续培养。 0PN形成的原因可能是原核未形成、原核消失或未受精的卵子。在原核未形成或原核消失的情况下，受精过程可能是正常的，但细胞周期可能比平常快或慢，因此无法确认原核的存在。一般来说，在成熟的卵子中，原核在授精后16～18 h出现。一项ICSI后的延时观察研究显示，原核最晚可在精子注射30.14 h后出现，最早可在注射后的6.16 h消失[15]。这表明，在授精16～18 h内未观察到原核，可能是由于确认受精时原核消失或尚未出现。然而，在大多数正常受精胚胎中，原核在授精后16～18 h不会消失。Nagy等[16]观察发现在授精16 h后99%(92/93)的2PN胚胎仍可见原核。在本研究中，0PN胚胎可能包括观察受精时原核已消失的胚胎或原核尚未形成的胚胎，但这种胚胎的比例很小。1PN的形成可能是由于：原核形成和/或原核消失的时间不恰当[17]；早期原核破裂或原核融合；父系或母系染色质的单性生殖发育。单性生殖发育可导致单倍体细胞，而前两种原因所形成的1PN可发育为正常的染色体数，因此，即使在1PN胚胎中也可能存在具有正常染色体数目的胚胎。有研究表明，1PN胚胎可以发育为正常的胚胎，并产生健康的后代[12，18-19]。

有研究显示，胚胎发育至融合阶段形成囊胚，胚胎基因组激活，能够发育至囊胚阶段的胚胎染色体异常率低，囊胚培养可以有效地从0PN和1PN来源的胚胎中选择染色体正常的胚胎，并用于新鲜周期或冷冻保存后的冻融周期移植[5]。有研究发现，进行冷冻解冻卵裂期胚胎移植时，0PN、1PN来源胚胎的植入率均显著低于2PN源性胚胎，然而进行囊胚移植时，3种胚胎的植入率差异并无统计学意义[8-9]。因此，本中心将0PN、1PN卵裂期胚胎行囊胚培养至第5～6天，观察其囊胚形成情况，将达到标准的囊胚进行冷冻，结果显示，通过c-IVF方式获得的0PN来源囊胚的妊娠结局与2PN来源囊胚相似，1PN来源囊胚的临床妊娠率及活产率低于0PN囊胚与2PN囊胚来源，但差异也并无统计学意义(P>0.05)。这表明在c-IVF周期中0PN、1PN来源的冻融囊胚可获得与2PN来源冻融囊胚相似的助孕结局，因此0PN与1PN来源囊胚仍具有一定的临床移植价值。但Liao等[20]研究报告，通过囊胚培养虽然可以筛选出单倍体胚胎，但不能消除嵌合体胚胎和多倍体胚胎。这表明仅根据1PN或0PN卵裂期胚胎是否能发育至囊胚期，并不能保证胚胎的安全性。有条件的生殖中心可将异常受精(0PN、1PN)来源的囊胚进行植入前基因检测后进行冷冻或移植以保证其移植的安全性。此外，胚胎发育是一个漫长且复杂的过程，不仅可能受实验室因素的影响，而且还可能受患者因素的影响。从实验室的角度看，培养液、培养温度和pH值是胚胎发育最重要的影响因素[21]，上述所有的变量都可能会影响受精评估结果，进而影响胚胎的进展和发育。因此，在实际工作中，评估0PN及1PN来源胚胎是否适合移植需考虑多种因素。

本研究中，0PN、1PN囊胚解冻移植后分别有13名、5名健康婴儿出生，并未发现存在先天畸形，这表明部分0PN、1PN来源胚胎是正常的，可以应用于临床移植。因此，在c-IVF周期中，当患者因2PN胚胎质量差无法移植或无2PN来源可利用胚胎时，0PN或1PN来源囊胚可作为备选胚胎进行移植。然而，1PN和0PN来源的胚胎移植并不常见，本研究中接受此类胚胎移植的受试者数量有限，因此无法评估使用这些胚胎的安全性。对于选择这一方案进行移植的患者，都必须给予充分的知情同意权。尽管在本研究中没有观察到先天畸形儿出生，但还需要进一步的详细研究，以探讨0PN、1PN来源胚胎移植的安全性。

综上所述，常规体外受精中形态正常的0PN、1PN囊胚有较好的发育潜能，在无2PN来源胚胎且患者充分知情同意的情况下可以考虑移植，但需严密随访临床妊娠过程及结局。