高效液相色谱法测安徽产地茶叶中咖啡因的含量*

王船英 邾枝花 季婷婷 许玉芳

安徽医学高等专科学校，安徽 合肥 230601

茶叶，山茶科植物茶Camellia sinensis（Linn．）O．Katze的干燥嫩叶。嫩枝无毛。叶革质，长圆形或椭圆形，先端钝或尖锐，基部楔形，上面发亮，下面无毛或初时有柔毛，边缘有锯齿，叶柄无毛。茶叶是中国传统饮品，入口涩，回味甘。茶叶中含有儿茶素、茶多酚、茶多糖、咖啡因等多种有益成分，各种成分均有不同的保健功效。［1⁃3］咖啡因（C8H10N4O2），弱碱性化合物，作为茶叶中的一种重要成分，咖啡因具有兴奋中枢神经系统，促进新陈代谢、消除疲劳、增加心脏和胃肠道功能的作用。［4⁃6］近年来研究显示，咖啡因可以预防阿尔茨海默病、早产儿支气管肺炎，适当饮用还可以降低肥胖、糖尿病和肿瘤的发病风险。因此研究茶叶中咖啡因的含量，可以合理利用茶叶的保健功能［7］。?

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

1.1.1仪器 高效液相色谱仪（Waters 1525⁃2489）；色谱柱（C18，5μm×4．6 mm×250 mm，大连依利特）；超声清洗仪（UP⁃2200H型）；万分之一电子天平（上海越平科学仪器有限公司）；AT⁃330柱温箱；电加热套；索氏提取装置；蒸馏装置；蒸发皿；熔点测定仪（北京科仪电光仪器，XT4B型）等。

1.1.2材料与试剂 茶叶（5批安徽不同产地市售茶叶，产地分别为黄山、霍山、桐城、岳西、六安）；咖啡因对照品（实验室自制）；氧化钙（分析纯）；氢氧化钠（分析纯）；95%乙醇（分析纯）；甲醇（色谱纯）；纯化水；0．45μm有机滤膜。

1.2 溶液的配制

1.2.1 对照品储备液的配制

1.2.1.1 对照品的提取精制 称取适量茶叶末，置于滤纸套筒中，250 ml圆底烧瓶中加入90 ml 95%乙醇，沸石5～6粒，利用索氏提取器装置连续回流1～2 h，回流液经蒸馏装置蒸馏浓缩，浓缩液转移至蒸发皿中，加入氧化钙3～4 g，沸水浴浓缩至黏稠，隔石棉网酒精灯加热，焙炒至干燥。用扎满小孔的滤纸盖在蒸发皿上，倒扣上普通玻璃漏斗，漏斗颈塞上脱脂棉，继续小火加热升华，至出现棕色烟雾，停止加热。收集滤纸上和漏斗壁上的晶体，晶体呈白色针状。［8-9］

1.2.1.2 咖啡因对照品的鉴别 取1.2.1.1项所得的晶体适量进行毛细管装样，将待测毛细管置于熔点测定仪中进行检测，得到所装样品的熔点为236.7～237.4℃。［10］熔点与咖啡因药典标准2010版一致。

1.2.1.3 对照品溶液的配制 精密称取实验室自制的咖啡因对照品0.0050 g，用甲醇溶解定容至50m l容量瓶中，制得对照品溶液浓度为1 mg·ml-1，备用。

1.2.2 茶叶样品溶液的制备 精密称取茶叶末1g，置于滤纸套筒中，圆底烧瓶中加70 ml 95%乙醇，利用索氏提取装置连续回流1.5 h后，将回流液用95%乙醇定容至100 m l容量瓶中。再从中吸取1 ml溶液用纯化水定容至5 ml容量瓶中，即得。5批样品溶液均用此方法制得。

1.3 色谱条件

色谱柱为C18(5μm×4.6 mm×250 mm);流动相为甲醇∶纯化水=(40∶60);流速为1ml·min-1;检测波长为271 nm［11-13］;柱温为室温;进样体积为20μl，所有进样溶液均经过0.45μm的微孔滤膜滤过。

1.4 线性关系考察

精密吸取1.2.1项的对照品储备液稀释成0.1 mg·m l-1、0.25 mg·ml-1、0.5 mg·ml-1、0.75 mg·ml-1不同浓度的对照品溶液。分别吸取过滤后的该5种不同浓度的对照品溶液20μl，注入色谱仪。以峰面积Y为纵坐标，以进样浓度X为横坐标进行线性回归，得回归方程Y=3×107X+673529，R2=0.999。结果表明，咖啡因在2～20μg之间，其浓度与峰面积呈良好的线性关系，见图1。咖啡因对照品色谱图见图2所示。

图1 咖啡因对照品线性关系

图2 咖啡因对照品HPLC图谱

1.5 精密度实验

精密吸取1.2.1项下已配制的1 mg.ml-1的咖啡因对照品溶液20μl，连续6次进样，得到咖啡因的峰面积。6次峰面积见表1所示。经过计算，其RSD值为0.16%，说明仪器精密度良好。

表1 精密度实验

1.6 重复性实验

吸取1.2.2项已配制的霍山产茶叶溶液6次分别进样，每次20μl，检测后咖啡因的峰面积见表2所示。经计算，其RSD值为1.9%，说明该方法重复性好。

表2 重复性实验

1.7 稳定性试验

精密吸取1.2.2项下黄山产茶叶溶液20μl，在1.3项色谱条件下，在放置0、4、8、12、24 h测定咖啡因峰面积见表3所示，并计算出RSD值为1.3%。说明待测样品溶液在24 h内稳定性良好。

表3 稳定性实验

2含量测定

精密称取5个产地茶叶，每份1 g，按1.2.2项方法制取样品溶液。过0.45μm微孔滤膜，待测。吸取每份溶液20μl进样。每份溶液各进两针。样品溶液的液相色谱图见图3。5份溶液共10次所测咖啡因峰面积见表4所示。

图3 茶叶样品溶液HPLC图谱

表4 5产地茶叶中咖啡因的含量

3结论

运用该实验方法对各产地茶叶中提取的咖啡因进行检查，结果表明:5批不同产地的茶叶中，咖啡因含量均不相同，但都不低于5%。其中六安产地茶叶含量最高为6.9%。整个实验检测结果准确性高，出峰快，操作过程灵活便捷，专属性强。此方法适合用于测定茶叶中咖啡因的含量。