IQGAP1在2型糖尿病肾病患者足细胞凋亡中的作用探究*

骆 青 孔 刚

山东第一医科大学附属泰山医院肾内科，山东 泰安 271000

糖尿病肾病是糖尿病最为重要的合并症之一，且临床上对于其病因、发病机制尚不知晓，普遍认为与遗传因素、肾脏血流动力学遗传、高血糖造成的代谢异常及高血压等有关[1]。同时，糖尿病肾病患者常伴有代谢紊乱，一旦发展到终末期肾病，导致临床治疗难度更大[2]。足细胞在人体中比较常见，通常多附着在肾小球基底膜外侧，能与肾小球基底膜、内皮细胞等相互结合，形成一个过滤保护屏障。临床研究表明[3]：足细胞在蛋白质滤过中发挥了重要的作用，再加上该细胞自我增殖能力较低，当细胞形态、功能或数量发生变化后，将会增加肾衰竭发生率[4]。因此，多数糖尿病患者由于机体内持续的高血糖，导致足细胞数量降低，造成足细胞从GBM上脱落随尿液排出从而形成局灶粘连和肾小球硬化[5]。IQ结构域 GTP 酶活化蛋白 1(IQGAP1)属于一种特殊的支架蛋白，含有多个蛋白域，能参与细胞的黏膜、细胞凋亡及增殖，但是在糖尿病肾病患者中的表达研究较少[6-7]。因此，本研究采用随机对照方法进行研究，探讨IQGAP1在糖尿病肾病患者足细胞凋亡中的作用，报道如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料

2015年1月—2019年12月就诊的糖尿病肾病患者24例，设为实验组，男15例，女9例，年龄31～80岁，平均(52.69±5.77)岁；病程1～7年，平均(3.47±0.56)年；体重44～78 kg，平均(67.89±4.61)kg。选择同期治疗的单纯原发性肾炎或肾病综合征患者12例，设为对照组，男7例，女5例，年龄30～81岁，平均(53.41±5.79)岁；体重45～75 kg，平均(66.71±4.58)kg。纳入标准：①符合糖尿病肾病诊断标准[8]，且患者均具有糖尿病史；②伴有不同程度肾功能不全或视网膜病变，且经糖尿病肾病检查确诊；③均在医嘱下完成检查、诊断。排除标准：①活动性蛋白尿患者，乙肝相关性肾炎患者、过敏性紫癜肾炎患者、系统性红斑狼疮患者、淀粉样变性、多发性骨髓瘤肾病等其他继发性肾脏病患者；②近期使用其他方法治疗或影响预后评估者；③合并恶性肿瘤、精神系统疾病后伴有自身免疫系统疾病者。

1.2 仪器与设备

表1 仪器与设备

1.3 方法

(1)IQGAP1、p-ERK1/2、ERK1/2表达。①检测方法。采用免疫组织化学法完成两组肾脏组织中IQGAP1、p-ERK1/2、ERK1/2表达水平检测。两组均经穿刺取肾脏组织，向组织中加入蒸馏水与浓度为30.0%H2O2，常温下加入内源性酶并进行10 min灭活，PBS连续进行3次洗涤。将最终获得的切片放置在0.01 M枸橼酸盐缓冲液中，加入生理盐水控制溶液PH最终为6。电炉加热直到煮沸，5 min间隔后再次煮沸，常温下冷却。采用PBS 2次洗涤，每次5 min，最后加入5%BSA封闭液并加入兔抗人IQGAP1、p-ERK1/2、ERK1/2蛋白(1∶100)一抗，一滴。滴加完毕后进行3次PBS洗涤；在1 ml底物中加入兔抗人IQGAP1、p-ERK1/2、ERK1/2蛋白二抗一滴，混合后常温下显色，苏木素复染后封片，倒置显微镜下观察细胞数量，每份标本测定三次，取平均值；②判断方法。参考奥尔雷德评分标准分别从细胞的阳性数量(阳性细胞数≤25.0%0分，26%～50.0%1分，51%～75%2分，>75%3分)、染色强度(不着色0分，黄色1分，棕黄色2分，黄褐色3分)完成免疫组化染色评分，总分16分，阳性率越高[9-10]。(2)相关性分析。采用SPSSPearson相关性分析软件分析IQGAP1与p-ERK1/2、ERK1/2表达及分布关系。

1.4 统计分析

2 结 果

2.1 两组IQGAP1、p-ERK1/2、ERK1/2阳性率比较

实验组糖尿病肾病组织中IQGAP1阳性率低于对照组(P<0.05)；实验组糖尿病肾病组织中p-ERK1/2、ERK1/2阳性率均高于对照组(P<0.05)，见表2。

表2 两组IQGAP1、p-ERK1/2、ERK1/2阳性率比较[n(%)]

2.2 IQGAP1在两组肾脏组织中的分布

免疫组化结果表明：实验组糖尿病肾病组织中足细胞裂隙变窄，足突缩小及伴有节段性融合，可见足细胞凋亡小体形成，IQGAP1分布在肾小球足细胞、系膜细胞、血管内皮细胞中；对照组肾脏组织中未见肾脏病变改变，IQGAP1表达水平较高，见图1。

图1 IQGAP1在肾脏组织中的分布(×200)

2.3 实验组中IQGAP1与p-ERK1/2、ERK1/2相关性分析

SPSSPearson相关性分析结果表明：实验组肾脏组织中IQGAP1与p-ERK1/2、ERK1/2蛋白阳性率呈负相关性(P<0.05)，见表3。

表3 实验组中IQGAP1与p-ERK1/2、ERK1/2相关性分析(r，P)

3 讨 论

数据报道显示[11]，糖尿病患者10年以上并发肾病率为30.0%，糖尿病肾病患者平均生存年限仅为10年，且多数患者由终末期肾衰竭引起。细胞凋亡又称为细胞程序性死亡，与糖尿病肾病发病关系密切。对于糖尿病肾病患者细胞的异常凋亡与氧化应激、内质网损伤及糖基化终末产物有关，多有肾小管上皮细胞、足细胞等多种细胞因子参与[12]。而高糖环境下肾脏足细胞凋亡是引起糖尿病肾病发生、发展的重要机制，但是临床上对于其具体机制尚未知晓。

IQGAP1属于一种细胞内支架蛋白，含有多个特殊蛋白结合域，上述特殊的结构域能与靶分子相互作用，在细胞凋亡、细胞形态及炎症介导中发挥重要的调节作用。国内学者研究表明[13]，IQGAP1在肾脏、胎盘及肺脏组织中表达。本研究中，实验组糖尿病肾病组织中IQGAP1阳性率低于对照组(P<0.05)；实验组糖尿病肾病组织中p-ERK1/2、ERK1/2阳性率均高于对照组(P<0.05)，说明IQGAP1在肾脏组织中呈低表达，能直接参与糖尿病肾病的发生、发展。最新研究表明：多种细胞通路能参与细胞凋亡的发展，MAPK信号通路是其中的一种。从大的角度来说，MAPK信号通路中含有MAPK激酶的激酶、MAPK激酶和MAPK。在正常人体中含有JNK/SAPK、P38MAPK家族及ERK1/2 MAPK家族。而在上述家族中ERK1/2 MAPK家族与细胞的增殖最为密切[14]。本研究中，免疫组化结果表明：实验组糖尿病肾病组织中足细胞裂隙变窄，足突缩小及伴有节段性融合，可见足细胞凋亡小体形成，IQGAP1分布在肾小球足细胞、系膜细胞、血管内皮细胞中；对照组肾脏组织中未见肾脏病变改变，IQGAP1表达水平较高，说明IQGAP1在糖尿病肾病组织中呈低表达，能直接参与疾病的发生、发展。

糖尿病肾病的发生、发展是一个多因素过程，常伴有微量白蛋白尿水平异常，而蛋白尿与足细胞损伤存在紧密的联系[15]。人肾脏足细胞属于一种终末分化的上皮细胞，具有相对复杂的细胞骨架系统，细胞之间通过足突嵌合在一起，形成相对完整的裂孔膜，这些裂孔膜的蛋白质分子之间能决定肾小球滤过的蛋白质分子量的大小，从而参与蛋白尿的调控作用[16]。但是，当足突间裂孔膜发生损伤后则会引起蛋白尿的发生，从而参与糖尿病肾病的发生、发展[17]。为了进一步研究IQGAP1在糖尿病肾病发生、发展中的作用，对IQGAP1与p-ERK1/2、ERK1/2蛋白水平进行SPSSPearson相关性分析，实验组肾脏组织中IQGAP1与p-ERK1/2、ERK1/2蛋白阳性率呈负相关性(P<0.05)，说明IQGAP1能直接参与糖尿病肾病的发展，且与p-ERK1/2、ERK1/2蛋白呈正相关性。因此，临床上糖尿病诊疗时可加强患者IQGAP1水平测定，根据测定结果帮助患者诊断；对于确诊的糖尿病肾病患者应加强血糖控制，采取有效的方法改善患者肾脏功能。

综上所述，IQGAP1在糖尿病肾病患者中呈低表达，且表达水平与p-ERK1/2、ERK1/2存在负相关性，可能由于p-ERK1/2、ERK1/2能引起足细胞凋亡，从而引起大量蛋白尿，导致糖尿病肾病的发生，但是其具体机制需要进一步研究与探讨。