莪术二酮对人宫颈癌Hela细胞增殖、凋亡和侵袭作用的研究

姜恩平，王 卓

(1.广东医科大学基础医学院病理学系,广东 东莞 523808；2.吉林市中心医院,吉林 吉林 132001)

宫颈癌是女性常见的恶性肿瘤，在我国其发病率和死亡率仅次于乳腺癌[1]。近年宫颈癌的发病逐渐增高并呈年轻化趋势[2]。临床上宫颈癌的治疗主要采用手术和放化疗方法，因临床化疗药物的多药耐药及不良反应，所以中药以其有效低毒的优势已成为治疗肿瘤的新途径。莪术是中药姜科植物蓬莪术、郁金以及广西莪术的干燥根茎，具有行气止血、止痛消炎等功效。 莪术二酮,又名姜黄二酮 、莪二酮，是莪术的主要有效成分之一，具有明显抗血栓、抗感染镇痛，神经保护等作用[3]。近年研究表明，莪术二酮还具有抗肿瘤作用，对乳腺癌、肝癌、肾癌等具有一定的抑制作用，能够抑制肿瘤细胞的生长[4-5]，但是对宫颈癌细胞增殖的影响及凋亡和侵袭等方面还未见报道。本研究以Hela细胞株为研究模型，探讨莪术二酮对宫颈癌的抑制作用，初步探讨其抗肿瘤的作用机制，为进一步研究莪术二酮抗肿瘤作用提供实验和理论依据。

1 材料与方法

1.1药品：本实验所用莪术二酮购自上海源叶生物科技有限公司；人Hela细胞购自中国科学院上海细胞生物学研究所；胎牛血清、DMEM培养基、0.25%胰蛋白酶和matrigel 基质胶购自美国Gibco公司；噻唑蓝(MTT)、二甲基亚砜(DMSO)购自Sigma公司；Annexin V-FITC凋亡试剂盒购自碧云天生物技术研究所。

1.2仪器：倒置显微镜(日本Nikon公司)，电热恒温水浴箱(江苏海门市麒麟医用仪器厂)，Synger2酶标仪(美国Biotek公司)。以上试剂和仪器均按照说明书制备和使用。本次研究经过我校医学伦理委员会同意。

1.3方法

1.3.1细胞培养：Hela细胞在含有10%胎牛血清和1%青-链霉素的DMEM培养液中，放置于含5% CO2、37 ℃的CO2培养箱中培养，隔2～3 d用0.25%胰蛋白酶消化传代一次，取对数期细胞对其进行增殖、凋亡和侵袭实验。Hela细胞分为对照组、莪术二酮低剂量组(12.5 μmol/L)、莪术二酮中剂量组(25 μmol/L)和莪术二酮高剂量组(50 μmol/L)等四组。细胞接种后24 h后加入不同浓度的莪术二酮继续孵育细胞12～48 h，消化收集细胞测定各项指标。

1.3.2MTT法检测细胞增殖的抑制实验：选取对数期的Hela细胞，进行胰蛋白酶进行消化、重悬，将细胞接种于96孔培养板，每组细胞为5复孔，于培养结束前4 h加入10 μl MTT，培养结束后去除孔内培养基，每孔加入DMSO 150 μl，摇床上振摇15 min，使蓝紫色的结晶完全溶解，用酶联免疫检测仪于570 nm波长处测定其吸光度值。对照组细胞增殖抑制率为0%，其余各组细胞增殖抑制率=(对照组吸光值-各组吸光值/对照组吸光值)×100%。

1.3.3流式细胞仪检测细胞凋亡：经上述处理的Hela细胞经胰酶消化后，用PBS溶液洗涤二次，置于离心机中以2 000 r/min的转速离心5 min，每份样本收集(1～5)×105个细胞，加入1 μl Annexin V-FITC混匀后加入5 μl Propidium Iodide混匀；室温下反应5 min，避光，然后进行流式细胞仪检测。总凋亡率=早期凋亡率+晚期凋亡率。

1.3.4Transwell小室法检测Hela细胞的侵袭能力：先将Matrigel用无血清的1 640培养基1∶5稀释，取50 μl均匀铺于小室上室，37 ℃静置1 h，使其干成胶状。将经上述处理的Hela细胞经胰酶消化后，调整细胞密度为5 × 105个/ml，接种于Transwell板内，上室加入含1%血清细胞悬液100 μl，下室加入含10% 胎牛血清的培养基500 μl，每组3复孔，在37 ℃含5% CO2培养箱内继续培养24 h取出小室，用棉签擦去上室未发生侵袭的细胞，PBS洗涤后,结晶紫染色15 min，显微镜下随机选择3个不同视野拍照并计数穿膜细胞，取平均值，并计算侵袭率。侵袭率=各给药组细胞数/对照组细胞数×100%。

2 结果

2.1莪术二酮对Hela细胞增殖的抑制作用：不同浓度的莪术二酮(12.5 μmol/L、25 μmol/L和50 μmol/L)作用Hela细胞后，能够明显地抑制其增殖，与对照组比较差异有统计学意义(P<0.01)，并具有时间和剂量依赖性关系，即随着剂量浓度的增加和时间的延长其抑制率明显升高。结果表明莪术二酮能够抑制Hela细胞的增殖。见表1。

表1 不同浓度莪术二酮对Hela细胞增殖的抑制作用(n=5)

2.2莪术二酮对Hela细胞凋亡的促进作用：不同浓度的莪术二酮(12.5 μmol/L、25 μmol/L和50 μmol/L)作用Hela细胞后48 h后，能够明显地诱导其凋亡，与对照组比较差异有统计学意义(P<0.01)，并具有剂量依赖性关系，即随着剂量的增加，凋亡率明显升高。结果表明莪术二酮能够诱导Hela细胞的凋亡。见表2。

表2 不同浓度莪术二酮对Hela细胞凋亡的作用(n=5)

2.3莪术二酮对Hela细胞侵袭能力的影响：与对照组比较，不同浓度的莪术二酮(12.5 μmol/L、25 μmol/L和50 μmol/L)作用48 h后，Hela细胞穿过基底膜的数量随着剂量的增加明显减少，侵袭率显著降低，差异有统计学意义(P<0.01)，表明莪术二酮能够剂量依赖性抑制Hela细胞的侵袭。见表3。

表3 不同浓度莪术二酮对Hela细胞侵袭的影响(n=3)

3 讨论

正常情况下细胞的增殖和凋亡维持一种动态平衡，一旦这种平衡失调，则可导致肿瘤的发生。细胞凋亡是由多种因素参与的复杂的生理过程，涉及基因调控、信号传导、免疫应答等方面。肿瘤是细胞增殖过度，凋亡受抑制使存活细胞多于死亡细胞所致的一类疾病。细胞在发生凋亡的过程中出现程序紊乱将会对肿瘤的形成起到促进作用，因此诱导肿瘤细胞凋亡可以作为治疗肿瘤的一个靶点。除了凋亡受到抑制，侵袭和转移也是恶性肿瘤的主要特征之一。肿瘤侵袭与转移过程复杂，涉及很多基因和信号分子的调控，如肿瘤侵袭和转移基因、肿瘤内和周围新血管的形成、细胞外基质降解、细胞黏附、肿瘤微环境等因素影响，如果这些环节出现异常，部分肿瘤细胞从原发病灶脱离，侵袭穿越基底膜并向周围组织浸润生长，或是突破血管壁进入到血管内形成瘤栓，随着血流运行，到达靶器官并与该部位血管的内皮细胞发生黏附，穿越管壁进入转移组织，完成肿瘤的侵袭和转移[6]。如果能够抑制或干扰肿瘤细胞侵袭和转移过程中的某些环节，将会对肿瘤的治疗起到积极的作用。中药近年在抗肿瘤方面取得了显著效果，中药可以通过多种途径来诱导肿瘤细胞凋亡和侵袭。研究表明中药对于肿瘤的治疗有其独特的优势，许多中药的有效成分能够诱导肿瘤细胞的凋亡，抑制肿瘤的侵袭和转移[7-8]。

莪术二酮是从中药莪术中提取的挥发油的主要有效成分之一，近年研究表明莪术二酮除了抗感染、镇痛、抑制血小板聚集等作用外，还具有抗肿瘤作用，对胃癌、乳腺癌等肿瘤细胞具有明显的抑制作用。本研究结果显示，莪术二酮能够明显抑制Hela细胞的增殖，随着剂量和时间的增加其抑制率逐渐增高；Annexin V-FITC凋亡结果显示莪术二酮能够剂量依赖性地诱导宫颈癌Hela细胞的凋亡；Transwell侵袭结果显示，莪术二酮能够剂量依赖性地抑制Hela细胞的侵袭。以上这些结果表明莪术二酮能够抑制宫颈癌Hela增殖和侵袭，并促进肿瘤细胞凋亡。本研究初步证实了莪术二酮抑制宫颈癌细胞的增殖和侵袭移的能力，此外其还具有较好的诱导宫颈癌细胞凋亡的作用,但具体机制与信号通路需进一步研究，莪术二酮在预防和治疗宫颈癌癌方面具有良好的应用前景。