牙周炎患者Hp生长分布对口腔环境及牙周膜细胞成骨能力影响

邓文革 张蕾 陈亚飞

(盘锦市中心医院，(1.口腔修复科门诊；(2.口腔治疗科门诊，辽宁 盘锦 124010；3.陈亚飞口腔诊所口腔科，辽宁 盘锦 124010)

研究[1]发现，口腔幽门螺栓菌(Hp)感染与牙周炎病程进展关系密切，牙周炎患者牙菌斑中的Hp检出率普遍高于健康者。牙周膜干细胞(PDLSCs)是公认的有利细胞，具有增殖分化能力，但受到基质微环境的影响。成骨相关钙化基因ALP、Runx-2表达，直接反映PDLSCs的成骨分化能力[2]。本文主要探讨牙周炎患者Hp生长分布对口腔环境及牙周膜细胞成骨能力影响。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2015年1月至2017年12月我院收治的牙周炎患者120例作为观察组，另选取30名同期于我院行口腔检查证实为牙周健康者作为对照组。观察组男68例、女52例，年龄15～45岁，平均(36.3±2.2)岁，按牙周炎程度分为轻度70例、中度27例、重度23例。对照组男18例、女12例，年龄14～46岁，平均(36.5±2.4)岁。纳入者均经口腔X线检查确诊为慢性牙周炎；已排除处于妊娠期或哺乳期的妇女；3个月内患有感染性疾病或接受过抗感染治疗；患有心肝肾等重要脏器疾病、恶性肿瘤或自身免疫病的患者。两组一般资料比较差异无统计学意义(P>0.05)。患者均知情同意。

1.2方法 患者使用0.9%氯化钠溶液含漱20 s，使用1 mL的无菌EP管收集含漱液，置于-80℃冰箱保存待检。采用二氧化硅微粒法提取含漱液中的DNA，口腔Hp分布采用聚合酶链式反应(PCR)检测。口腔Hp阳性结果判断标准：CagA基因表达阳性为在397 bp处出现特异性条带(CagA基因表达阳性)或294 bp条带处出现特异性条带(尿素酶 C基因表达阳性)，上述位置出现一处特异性条带即为口腔Hp阳性。两组均选取同侧1、4、6牙位，采用世界卫生组织推荐的CPI牙周探针检测牙周袋深度，记录菌斑指数，采用视诊结合探针的方法进行检查，用探针轻划牙面，根据菌斑的量和厚度进行计分，菌斑指数=各牙齿斑计分之和与被检查总牙数之比。将pH试纸裁剪为直径6 mm左右的小圆片，插入牙周袋，30 s后取出，记录牙周袋深度及龈沟液pH值。收集观察组中因牙周炎拔出的新鲜牙的组织及对照组中因正畸治疗需要拔除新鲜牙的组织，PBS反复冲洗，在超净工作台中刮取根中1/3牙周膜组织，尽可能剪碎，形成小组织块，采用组织块酶消化法分离细胞，进行PDLSCs原代培养，待细胞生长密度达80%左右时，采用低密度法筛选，进行传代培养，取第4代细胞提取总 RNA，逆转录合成cDNA模板，采用PrimeScript TM RT reagent Kit逆转录试剂盒。采用RT-PCR 法检测ALP、Runx-2表达情况，试剂盒购自Takara公司，仪器使用ABI 7000 RT-PCR仪，PCR引物委托上海生工生物工程技术有限公司合成。

2 结 果

2.1口腔Hp分布情况的比较 观察组的口腔Hp阳性率为84.17%，显著高于对照组的43.33%，差异有统计学意义(χ2=21.937，P<0.05)。

2.2不同程度牙周炎的口腔Hp分布情况 随着牙周炎程度加重，口腔Hp阳性率显著升高(P<0.05)。见表1。

表1 不同程度牙周炎的口腔Hp分布情况[n(%)]

2.3两组口腔环境比较 Hp阳性者的牙周袋深度、龈沟液pH值、菌斑指数均高于Hp阴性(P<0.05)，观察组显著高于对照组(P<0.05)。见表2。

表2 两组口腔环境比较

2.4两组ALP、Runx-2 mRNA水平比较 对照组HP阳性者与阴性者的ALP、Runx-2 mRNA水平无显著差异(P>0.05)，观察组HP阳性者的ALP、Runx-2 mRNA水平显著低于Hp阴性者(P<0.05)，观察组显著低于对照组(P<0.05)。见表3。

表3 两组ALP、Runx-2 mRNA水平比较

3 讨 论

研究[3]发现，胃炎患者牙菌斑分离得到的Hp与胃粘膜Hp的生化特性、形态和免疫特性类似，因此推断除胃以外，口腔是重要的人体Hp贮存地。口腔内环境直接影响口腔Hp生长及分布。本文结果显示，观察组的口腔Hp阳性率显著高于对照组；随着牙周炎程度加重，口腔Hp阳性率显著升高，提示牙周组织破坏程度越严重，越有利于口腔Hp的生长分布。Hp阳性者的牙周袋深度、龈沟液pH值、菌斑指数均高于Hp阴性，观察组显著高于对照组。

ALP是一类由肝脏外排的同工酶，在人体胎盘、骨骼、肝脏、肾等多种组织均有分布，参与骨等矿化组织代谢再生。ALP 活性是成骨细胞早期分化的标志物，也是其分化程度及功能的指示指标。牙周膜细胞在牙周组织修复重建过程中扮演重要角色，研究[4]表明，牙周膜细胞具有成骨的能力，细胞ALP 表达水平直接反映成骨细胞活性。研究[5]发现，Runx-2在骨组织形成和重建等过程中发挥重要作用，成骨细胞增殖分化时，Runx-2表达上调，说明两者具有密切联系。本文中，对照组Hp阳性者与阴性者的ALP、Runx-2 mRNA水平无显著差异，观察组Hp阳性者的ALP、Runx-2 mRNA水平显著低于Hp阴性者，说明牙周炎患者牙周膜细胞成骨分化的矿化程度降低，成骨分化能力明显降低，影响牙周组织的修复与重建。但Hp感染并不一定是导致牙周膜细胞成骨能力下降的直接因素。研究[6]发现，口腔发生局部炎症时，大量炎性因子分泌到胞外，刺激PDLSCs，削弱其分化能力，下调成骨能力，直接影响牙周组织再生。因此，推测可能是Hp感染加重了牙周炎患者的炎症程度，炎性因子水平升高，进一步减弱牙周膜细胞成骨能力。