基于抗炎及抗氧化研究人参皂苷对衰老模型大鼠七氟烷麻醉后认知功能障碍的改善作用

樊荣

(西安市第一医院麻醉科，陕西 西安 710002)

七氟烷是临床广泛使用的吸入型麻醉药物，麻醉和镇静效果确切且对呼吸和循环系统影响较小，但有研究[1-2]发现，其会对老年患者的认知功能产生负面影响。另有研究[3]显示，七氟烷会对衰老大鼠的认知功能及海马超微结构造成损害。人参皂苷是人参中主要的活性成分，人参皂苷Re为人参皂苷中重要的一种单体成分，能够在多种组织中发挥抗炎和抗氧化作用。研究[4]表明，人参皂苷Re能够减轻慢性酒精中毒引起认知功能损伤。基于此，本实验将人参皂苷Re用于衰老模型大鼠七氟烷麻醉后的干预，具体分析了人参皂苷Re对认知功能障碍及炎症反应、氧化应激反应的改善作用及机制。

1 材料与方法

1.1材料 成年雄性SD大鼠购自上海西普尔-必凯实验动物有限公司，D-半乳糖购自北京索莱宝公司，七氟烷购自山东鲁南贝特制药公司，白介素-1β(IL-1β)、白介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)、丙二醛(MDA)的检测试剂盒购自北京全式金公司，RIPA裂解液、BCA蛋白检测试剂盒购自武汉艾来德公司，p-p38MAPK、p-ERK1/2、p-JNK的抗体购自CST公司。

1.2方法 实验动物随机分为对照组、衰老组、衰老+七氟烷组、衰老+七氟烷+人参皂苷组，每组各8只。衰老组、衰老+七氟烷组、衰老+七氟烷+人参皂苷组进行衰老模型制备，皮下注射0.125 g/kg 10%D-半乳糖溶液、1次/d、连续40 d；对照组皮下注射等剂量生理盐水。衰老+七氟烷组、衰老+七氟烷+人参皂苷组在衰老模型造模完成后放入麻醉箱内，通入3.2%七氟烷、持续6 h；对照组和衰老组放入麻醉箱内，通入空气。经上述处理后，衰老+七氟烷+人参皂苷组给予50 mg/kg人参皂苷Re灌胃、1次/d、连续4周。于直径1.6 m、高0.5 m的水迷宫内进行检测，水深0.22 m，水温22～26℃。第1～4天进行定位航行实验，在第3象限正中放置直径12 cm、高度20 cm的平台，每天训练4次，分别从4个象限将大鼠面向池壁放入水中，记录大鼠找到平台的时间，若90 s内未找到平台，则逃避潜伏期为90 s；第5天进行空间探索实验，将大鼠从第1象限面向池壁放入水中，记录大鼠90 s内穿越原平台所在位置的次数。完成Morris水迷宫检测后处死大鼠，收集外周血3～5 mL后离心分离血清；收集海马组织，加入RIPA裂解液后匀浆，离心分离上清，采用试剂盒分别检测血清及上清中IL-1β、IL-6、TNF-α、SOD、GPX、MDA的含量。取海马组织匀浆后的上清液，采用BCA试剂盒测定蛋白含量，根据测定结果取含有30 μg蛋白的上清样本进行Western blot实验。将样本加入聚丙烯酰胺凝胶后进行电泳，而后电转移至PVDF膜，5%脱脂牛奶在室温封闭PVDF膜1 h后1∶1 000稀释的p-p38MAPK、p-ERK1/2、p-JNK抗体或1∶5 000稀释的β-actin抗体4℃孵育过夜；TBS-T溶液洗膜3遍、每遍5 min，室温孵育1∶2 000稀释的二抗1 h，再次TBS-T溶液洗膜3遍、每遍10 min，最后在凝胶成像系统中显影，得到p-p38MAPK、p-ERK1/2、p-JNK、β-actin条带，根据条带的灰度值计算蛋白表达量。

1.3统计学方法 采用SPSS20.0软件录入数据，四组间计量资料的比较采用方差分析，两两比较采用LSD-t法，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1学习记忆功能的比较 与对照组比较，衰老组大鼠的逃避潜伏期延长，穿越平台次数减少(P<0.05)；与衰老组比较，衰老+七氟烷组大鼠的逃避潜伏期延长，穿越平台次数减少(P<0.05)；与衰老+七氟烷组比较，衰老+七氟烷+人参皂苷组大鼠的逃避潜伏期缩短，穿越平台次数增加(P<0.05)。见表1。

表1 各组大鼠学习记忆功能的比较

2.2血清及海马中炎症因子含量的比较 与对照组比较，衰老组大鼠血清及海马中IL-1β、IL-6、TNF-α的含量增加(P<0.05)；与衰老组比较，衰老+七氟烷组大鼠血清及海马中IL-1β、IL-6、TNF-α的含量减少(P<0.05)；与衰老+七氟烷组比较，衰老+七氟烷+人参皂苷组大鼠血清及海马中IL-1β、IL-6、TNF-α的含量增加(P<0.05)。见表2。

表2 各组大鼠血清及海马中炎症因子含量的比较

2.3血清及海马中氧化应激指标的比较 与对照组比较，衰老组大鼠血清及海马中SOD、GPX的含量减少，MDA的含量增加(P<0.05)；与衰老组比较，衰老+七氟烷组大鼠血清及海马中SOD、GPX的含量增加，MDA的含量减少(P<0.05)；与衰老+七氟烷组比较，衰老+七氟烷+人参皂苷组大鼠血清及海马中SOD、GPX的含量减少，MDA的含量增加(P<0.05)。见表3。

表3 各组大鼠血清及海马中应激指标的比较

2.4p38MAPK、ERK1/2、JNK表达的比较 与对照组比较，衰老组大鼠海马中p-p38MAPK、p-JNK的表达水平增加，p-ERK1/2的表达水平减少(P<0.05)；与衰老组比较，衰老+七氟烷组大鼠海马中p-p38MAPK、p-JNK的表达水平增加，p-ERK1/2的表达水平减少(P<0.05)；与衰老+七氟烷组比较，衰老+七氟烷+人参皂苷组大鼠海马中p-p38MAPK的表达水平无明显变化(P>0.05)，p-JNK的表达水平减少、p-ERK1/2的表达水平增加(P<0.05)。见图1，表4。

图1 各组大鼠海马中p-p38MAPK、p-ERK1/2、p-JNK的蛋白条带

表4 各组大鼠海马中p-p38MAPK、p-ERK1/2、p-JNK表达量的比较

3 讨 论

人参皂苷Re是人参皂苷中重要的一种单体成分，具有广泛的生物学作用。有学者[5-6]分别将人参皂苷Re用于精神分裂症大鼠及阿尔茨海默小鼠的干预，结果显示动物的行为学表现及认知功能均明显改善。本研究结果显示，与衰老+七氟烷组比较，衰老+七氟烷+人参皂苷组的逃避潜伏期缩短、穿越平台次数增加，表明人参皂苷Re对衰老大鼠七氟烷麻醉后的认识功能具有改善作用。

海马是大脑中与认知、学习、记忆等功能直接相关的脑区，海马结构的损害能够引起认知功能障碍、学习记忆能力减退。研究[7-8]表明，在七氟烷诱导认知功能障碍的过程中，海马中的炎症反应和氧化应激反应的激活与结构损害直接相关。本研究表明，衰老组及衰老+七氟烷组血清、海马中IL-1β、IL-6、TNF-α、MDA的含量增加，SOD、GPX的含量减少且衰老+七氟烷组的上述变化较衰老组更为显著，表明衰老及七氟烷麻醉均对海马中的炎症和氧化应激反应具有激活作用。人参皂苷Re具有抗炎和抗氧化作用，能够在神经元细胞、内皮细胞、心肌细胞中减轻多种病理因素引起的炎症反应和氧化应激反应[9-10]。本研究结果显示，血清、海马中IL-1β、IL-6、TNF-α、MDA的含量减少，SOD、GPX的含量增加，表明人参皂苷Re能够在衰老大鼠七氟烷麻醉后发挥抗炎和抗氧化作用，这可能是其改善认知功能的机制之一。

MAPK通路是细胞内感受能量变化并调控凋亡、炎症、氧化应激的重要通路，ERK1/2、JNK、p38MAPK均属于MAPK家族。报道[11-12]显示，七氟烷能够使海马中的JNK、p38MAPK发生激活，ERK1/2受到抑制。本研究结果显示，衰老+七氟烷组海马中p-p38MAPK、p-JNK的表达水平增加，p-ERK1/2的表达水平减少，表明上述信号通路的变化可能参与了七氟烷诱导的海马组织炎症及氧化应激激活，进而引起认知功能减退。在人参皂苷Re干预后，海马中p-p38MAPK的表达水平无明显变化、p-JNK的表达水平减少、p-ERK1/2的表达水平增加，表明人参皂苷Re可能通过ERK1/2和JNK通路发挥改善认知功能及抑制炎症反应、氧化应激反应的作用。