血管细胞黏附分子-1和激活素A对多发性骨髓瘤的影响研究

王岩，黄仲夏，胡婉莉，魏宇君，王林月

多发性骨髓瘤（MM）是一种好发于中老年人的恶性浆细胞肿瘤，骨髓中浆细胞恶性增殖，产生大量单克隆免疫球蛋白（又称M蛋白），伴有高钙血症、肾损害、贫血及骨质破坏等症状，又称为症状性或活动性骨髓瘤。近几年其发病率明显增高［1］，在过去的20年中，靶向新药的应用明显改善了患者的预后，但MM仍不可治愈［2］，其发病机制不明。基础研究发现，MM中肿瘤细胞对骨髓微环境高度依赖［3］。血管细胞黏附分子-1（VCAM-1）和激活素A作为人体多功能细胞因子，与感染、免疫、肾病和创伤修复等有关［4-10］。本文旨在探究肿瘤微环境中VCAM-1和激活素A对MM的影响。

1 对象与方法

1.1 研究对象 选取2012年1月—2014年4月北京朝阳医院西院血液与肿瘤科收治的50例MM住院患者作为研究对象，男女各25例，年龄39～81岁，平均年龄（63.4±11.2）岁，患者确诊前均完善了骨髓细胞学、血尿M蛋白鉴定及免疫固定电泳、血常规、肝肾功能及影像学检查，MM的诊断、分期和治疗反应的评判依据国际骨髓瘤工作组（IMWG）的标准［11］。同时选取在本院体检的健康人20例作为对照组，其中男8例，女12例；年龄37～65岁，平均年龄（52.4±9.3）岁。

患者均符合MM诊断标准［11］，存在10%以上的克隆性浆细胞或病理组织活检证实克隆性浆细胞瘤，伴血或尿中M蛋白升高，并具备CRAB症状之一，血钙升高（Ca＞2.75 mmol/L），肾损害〔血肌酐（Scr）＞177 μmmol/L〕，贫血〔血红蛋白（Hb）＜100 g//L〕和骨损害（骨损害依据放射科CT、核磁或PET-CT影像学报告的溶骨性骨质破坏）。纳入标准：明确诊断MM的初诊、复发及治疗后达完全反应（CR，即M蛋白消失，CRAB症状缓解）或比较好的部分缓解（VGPR，指M蛋白下降90%以上，病情减轻）的患者；排除标准：化疗不足2个疗程、疗效评估达不到部分缓解（PR）及以上疗效的MM患者，浆细胞白血病、淀粉样变性或实体肿瘤骨转移和全身广泛性骨质疏松但缺乏溶骨性骨质破坏影像学证据的患者。留取标本时患者均无发热或感染表现。所有患者或家属签署知情同意书，本研究获取了本院伦理委员会批准。

1.2 方法 40例患者初始治疗给予沙利度胺联合地塞米松和表阿霉素的方案〔沙利度胺：100 mg，口服；地塞米松：20 mg，晨服，第1～4天；表阿霉素：9 mg·（m2）-1·d-1，第 1～4天，静脉滴注〕。10例患者初始治疗给予硼替佐米联合地塞米松联合异环磷酰胺的方案（硼替佐米：1.0～1.3 mg/m2，第1、4、8、11天，静脉注射；地塞米松：20 mg/d，第1、4、8、11天，口服；异环磷酰胺：0.5 g/d，第1～4天。21 d为1个周期）4～6个周期。治疗期间常规给予止吐、保护胃黏膜、保肝、水化碱化尿液治疗；应用异环磷酰胺时给予美司那解救；无禁忌证的患者给予口服拜阿司匹林或皮下注射低分子肝素预防静脉血栓；应用硼替佐米期间给予阿昔洛韦口服抗病毒治疗。对重度贫血、血小板计数减少的患者酌情给予成分输血等支持治疗。肾功能正常的患者每月应用双磷酸盐治疗骨髓瘤骨病。

获得CR或VGPR患者，再巩固治疗2～4个周期后，用沙利度胺或来那度胺口服维持治疗。肠溶阿司匹林或低分子量肝素常规预防静脉血栓形成，如果没有禁忌证，抗病毒药物预防带状疱疹，双磷酸盐静脉注射用于骨髓瘤骨病防治每月1次。

随访时间2018年4月—2019年4月，以电话等形式随访患者生存和身体健康状态，每3～6个月随访1次，如果前一年未见患者或失联，需要提供死亡证明。

1.3 分组 根据治疗后患者的病情状态分组，新诊断MM（new disgnosed MM，NDMM）组18例、复发MM（respased MM，RMM）组18例和治疗反应（responsed group，RG，指治疗后疗效达到CR和VGPR的患者）组14例。其中NDMM组男6例、女12例，平均年龄（64.5±13.8）岁；RMM组男11例、女7例，平均年龄（60.9±9.9）岁；RG组男8例、女6例，平均年龄（66.6±8.7）岁。

根据是否有肾损害（Scr＞177 μmmol/L）分为肾损害（kidney injured group，KI）组及非肾损害（non-kidney injured，NKI）组，分别为12例及38例；根据是否有贫血（Hb＜100 g/L）分为贫血组及非贫血组，分别为29例及21例；根据患者骨病程度分组，依据颅脑、骨盆X线，胸腰椎CT或MRI中溶骨性骨骼破坏的严重程度分为严重骨病变（severe bone lesions，SBL）组27例和非严重骨病变（non-severe bone lesions，NSBL）组23例，SBL指存在＞3处溶骨性骨病变或发生过骨相关事件包括病理性骨折、脊髓压迫、高钙血症的患者，NSBL指存在0～3处骨损害者。

本研究价值：

多发性骨髓瘤（MM）的误诊率高达40%～60%、发病率仅次于淋巴瘤的第二大血液肿瘤，硼替佐米、来那度胺等靶向新药的应用改善了患者的生存，但MM仍不可治愈，其发病机制不清楚。基础研究发现，MM中肿瘤细胞对骨髓微环境高度依赖。本文旨在探究MM患者肿瘤微环境中诸多细胞因子如血管细胞黏附分子-1（VCAM-1）和激活素A等因子与MM发病的相关关系及临床意义。研究结果显示，肿瘤微环境中升高的VCAM-1和激活素A一起参与MM病情进展，且与MM的肾病、贫血和骨病等症状的病理过程相关，提示其有希望成为未来抗MM治疗的新靶点。通过该研究，有利于临床大夫了解MM的典型临床表现和复杂的病理生理变化，虽然50%MM患者以肾损害、80%～90%患者以骨损害等非血液系统症状发病，但理解该病的本质，将有利于该病的诊治，延长患者的生存期。

1.4 试剂和方法 收集MM患者治疗前及对照组外周血各3 ml，1 500 r/min离心10 min后分离血清，-80 ℃冰箱冻存。检测VCAM-1、激活素A、Scr、β2-微球蛋白、乳酸脱氢酶、骨髓中骨髓瘤细胞数目、清蛋白、Hb、25-羟维生素D3、血清骨特异性碱性磷酸酶（bone alkaline phosphatase，bALP）、抗酒石酸酸性磷酸酶（tartrate-resistant acid phosphatase，TRACP-5b）、Ⅰ型胶原吡啶交联终肽（pyridinoline cross-linked carboxyterminal telopeptide of type I collagen，ICTP）、M蛋白量、血游离轻链量（κ/λ比值）、白介素（IL）-6、IL-6R、肿瘤坏死因子α（TNF-α）和血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）。

VCAM-1和激活素A ELISA试剂盒，购自R&D公司；25-羟维生素D3、bALP、TRACP-5b、ICTP骨病指标检测ELISA试剂盒，购自英国IDS公司；IL-6、IL-6R、TNF-α和VEGF骨髓瘤相关细胞因子检测ELISA试剂盒，购自法国Diaclone公司。

按试剂盒说明书和实验室常规操作。采用ELISA法，在孔板中加入标本及标准品，依次加入工作液、底物溶液分别温育后加入终止液，用酶标仪在450 nm波长测量各孔的光密度值（OD值）。根据标准品绘制标准曲线，计算各标本浓度。

1.5 统计学方法 采用SPSS 19.0软件进行数据分析。计量资料以（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验；相关性分析采用Pearson相关分析；采用受试者工作特征曲线（ROC曲线）评价VCAM-1和激活素A诊断MM的最佳截断值；采用Kaplan-Meier法绘制生存曲线。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 NDMM组、RMM组、RG组、对照组VCAM-1和激活素A水平比较 4组VCAM-1、激活素A水平比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。NDMM组、RMM组VCAM-1水平均高于对照组、RG组，差异有统计学意义（P＜0.05）；RG组与对照组VCAM-1水平比较，差异无统计学意义（P=0.336）；NDMM组与RMM组VCAM-1水平比较，差异无统计学意义（P=0.135，见表1）。

NDMM组、RMM组激活素A水平均高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）；RG组与对照组激活素A水平比较，差异无统计学意义（P=0.409）；NDMM组激活素A水平高于RG组，差异有统计学意义（P＜0.05）；RMM组与RG组激活素A水平比较，差异无统计学意义（P=0.091）；NDMM组与RMM组激活素A水平比较，差异无统计学意义（P=0.562，见表1）。

表1 NDMM组、RMM组、RG组、对照组VCAM-1和激活素A水平比较（±s）Table 1 Comparison of activin A and VCAM-1 levels between multiple myeloma patients and healthy controls，and between multiple myeloma patients by post-treatment condition，kidney impairment prevalence，anemia prevalence，and bone lesion level

表1 NDMM组、RMM组、RG组、对照组VCAM-1和激活素A水平比较（±s）Table 1 Comparison of activin A and VCAM-1 levels between multiple myeloma patients and healthy controls，and between multiple myeloma patients by post-treatment condition，kidney impairment prevalence，anemia prevalence，and bone lesion level

注：VCAM-1=血管细胞黏附分子-1，MM=多发性骨髓瘤，NDMM=新诊断MM，RMM=复发MM，RG=治疗反应；与对照组比较，aP＜0.05；与NDMM组比较，bP＜0.05；与RMM组比较，cP＜0.05

组别 例数 VCAM-1（μg/L） 激活素A（ng/L）对照组 20 826.1±62.5 320.6±39.2 NDMM 组 18 2 111.6±201.1a 829.7±142.0a RMM 组 18 1 774.5±167.8a 745.7±101.8a RG 组 14 1 094.5±129.4bc 470.2±51.9b F值 11.3 4.2 P值 ＜0.01 0.01

2.2 KI组、NKI组、对照组VCAM-1和激活素A水平比较 3组VCAM-1和激活素A水平比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。KI组VCAM-1、激活素A水平高于NKI组、对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）。NKI组VCAM-1、激活素A水平高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05，见表2）。

表2 KI组、NKI组、对照组VCAM-1和激活素A水平比较（±s）Table 2 Changes of VCAM-1 and activin A levels in multiple myeloma patients with injured kidney

表2 KI组、NKI组、对照组VCAM-1和激活素A水平比较（±s）Table 2 Changes of VCAM-1 and activin A levels in multiple myeloma patients with injured kidney

注：KI=肾损害，NKI=非肾损害；与对照组比较，aP＜0.05；与KI组比较，bP＜0.05

images/BZ_77_1276_1390_2276_1451.png对照组 20 826.1±62.5 320.6±39.2 KI组 12 2 460.2±381.7a 1 255.1±257.2a NKI组 38 1 497.4±93.8ab 612.7±52.8ab F值 14.9 13.5 P值 ＜0.01 ＜0.01

2.3 贫血组、非贫血组、对照组VCAM-1和激活素A水平比较 3组VCAM-1和激活素A水平比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。贫血组VCAM-1、激活素A水平高于对照组、非贫血组，差异有统计学意义（P＜0.05）；非贫血组VCAM-1、激活素A水平与对照组比较，差异无统计学意义（P＞0.05，见表3）。

表3 贫血组、非贫血组、对照组VCAM-1和激活素A水平比较（±s）Table 3 Levels of activin A and VCAM-1 in multiple myeloma patients with anemia

表3 贫血组、非贫血组、对照组VCAM-1和激活素A水平比较（±s）Table 3 Levels of activin A and VCAM-1 in multiple myeloma patients with anemia

注：与对照组比较，aP＜0.05；与贫血组比较，bP＜0.05

对照组 20 826.1±62.5 320.6±39.2贫血组 29 2 094.7±176.7a 1 005.0±124.2a非贫血组 21 1 328.6.±114.1b 482.8±37.3b F值 15.4 13.6 P 值 ＜0.01 ＜0.01images/BZ_77_1276_2102_2278_2160.png

2.4 SBL组、NSBL组、对照组激活素A和VCAM-1水平比较 3组VCAM-1和激活素A水平比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。SBL组、NSBL组激活素A水平高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）。SBL组激活素A水平高于NSBL组，差异有统计学意义（P＜0.05）。SBL组、NSBL组VCAM-1水平高于对照组（P＜0.05），但SBL组、NSBL组比较，差异无统计学意义（P＞0.05，见表4）。

表4 SBL组、NSBL组、对照组VCAM-1和激活素A水平比较（±s）Table 4 Comparison of activin A levels in multiple myeloma patients with and without severe bone lesions

表4 SBL组、NSBL组、对照组VCAM-1和激活素A水平比较（±s）Table 4 Comparison of activin A levels in multiple myeloma patients with and without severe bone lesions

注：SBL=严重骨病变，NSBL=非严重骨病变；与对照组比较，aP＜0.05；与SBL 组比较，bP＜0.05

对照组 20 826.1±62.5 320.6±39.2 SBL 组 27 1 756.1±153.2a 960.3±662.5a NSBL 组 23 1 579.5±191.3a 606.3±367.4ab F值 5.400 3.215 P值 0.007 0.048images/BZ_77_1276_2743_2276_2800.png

2.5 相关关系和生存分析 VCAM-1的水平与激活素A（n=46，r=0.63，P＜0.001）、Scr（n=47，r=0.42，P=0.004）、β2-微球蛋白（n=49，r=54.97，P=0.001）、乳酸脱氢酶（n=44，r=0.97，P=0.028）、骨髓中骨髓瘤细胞数目（n=25，r=1 684.38，P=0.045）呈正相关；与清蛋白（n=44，r=-0.59，P＜0.001）和Hb（n=44，r=-0.59，P＜0.001）呈负相关。

VCAM-1水平与骨生成指标bALP（n=26，r=7.33，P=0.580）、骨破坏指标 TRAP-5b（n=26，r=-96.28，P=0.270）、M 蛋白量（n=24，r=-0.06，P=0.560）、血游离轻链量（κ/λ 比 值 ）（n=11，r=-47.44，P=0.330）、IL-6R（n=9，r=-0.30，P=0.650）、TNF-α（n=9，r=-22.60，P=0.460）、VEGF（n=9，r=1.08，P=0.620）水平无直线相关关系。

激活素A水平与Scr（n=47，r=0.66，P=0.026）、IL-6（n=12，r=0.53，P＜0.001）水平和骨吸收指标ICTP（n=30，r=0.70，P＜0.001）呈正相关，与血红蛋白水平（n=44，r=-0.55，P＜0.001）呈负相关。激活素A水平与β2-微球蛋白（n=49，r=0.16，P=0.190）、白蛋白（n=48，r=-14.81，P=0.310）、乳酸脱氢酶（n=44，r=0.30，P=0.370）、骨髓中骨髓瘤细胞数目（n=25，r=1 185.26，P=0.100）、与骨生成指标bALP（n=26，r=0.58，P=0.950）、 骨破坏指标 TRAP-5b （n=26，r=19.66，P=0.740）、M 蛋白量（n=24，r=-0.08，P=0.370）、血游离轻链量（κ/λ比值）（n=11，r=-59.61，P=0.180）、IL-6R（n=9，r=0.00，P=0.990）、TNF-α（n=9，r=-8.12，P=0.560）、VEGF（n=9，r=-0.81，P=0.410）等无直线相关关系。

在资料齐全的32例MM患者中，根据ROC曲线得出VCAM-1诊断MM的最佳截断值为1 443.3 μg/L、激活素A诊断MM的最佳截断值为550.7 ng/L。VCAM-1＞1 443.3 μg/L患者累积生存率低于VCAM-1＜1 443.3 μg/L患者，差异有统计学意义（χ2=17.105，P＜0.001，见图1）。激活素A＞550.7 ng/L患者累积生存率低于＜550.7 ng/L患者，差异有统计学意义（χ2=15.379，P＜0.001，见图 2）。

图1 VCAM-1对总生存期的影响Figure 1 Impact of VCAM-1 on cumulative survival rate in multiple myeloma patients

图2 激活素A对总生存期的影响Figure 2 Impact of activin A on cumulative survival rate in multiple myeloma patients

3 讨论

本研究显示NDMM和RMM患者血清VCAM-1和激活素A水平较对照明显升高，生存研究也发现，VCAM-1＞1 443.3 μg/L或激活素A超过550.7 ng/L，其总体生存率明显缩短。而且，高水平激活素A与IL-6一起直接或间接引起MM病情进展，与TERPOS等［12］的结果类似。原因可能是升高的VCAM-1和激活素A参与了MM发病的病理过程，与MM病情进展和程度一致。

肾活检是KI诊断的金标准，但有很多局限性。尿液中测得的可溶性VCAM-1与狼疮性肾炎、临床和组织学活性指标以及更严重的肾脏病变密切相关［13］。激活素A也与急性或慢性肾损伤、肾脏内皮细胞激活和功能失调有关［14-17］。并通过肾纤维化等引起慢性肾病，刺激骨吸收增加，引起慢性肾病-骨矿物质骨病（CKD-MBD）综合征。尿VCAM-1可能有希望成为红斑狼疮等肾病的生物标志物［13］。目前研究发现，KI患者血清VCAM-1和激活素A水平高于NKI患者，且两者均与Scr水平呈正相关。原因可能是两者参与了骨髓瘤肾病的病理过程。尿激活素A反映MM的肾小管损伤，可能有助于早期检测MM相关的肾功能不全［18］。进一步佐证了激活素A与肾损伤有关。

本研究发现，贫血患者的VCAM-1和激活素A水平高于非贫血组MM患者。且发现两者均与Hb水平呈负相关，原因可能是两者参与了MM患者贫血形成的复杂机制。在临床试验中，人源化的激活素A拮抗剂Sotatercept（ActRIIA.muFc）可对抗肿瘤引起的贫血，改善化疗引起的贫血，有可能作为促红细胞生成素替换剂应用于MM患者贫血的治疗中［19］，且有增加骨量的附加优势［12］。激活素A引起肿瘤相关贫血的机制不明。对慢性疾病贫血的大鼠模型研究发现，可以与骨形态发生蛋白（BMP）结合的激酶活化素A受体Ⅰ型（ACVR1）参与慢性疾病贫血的发生的复杂机制［20］。

本研究结果显示，SBL患者较NSBL患者激活素A水平高，且与溶骨性骨代谢指标ICTP呈正相关。说明可能激活素A参与MM骨病的发生，与MM的溶骨性骨质破坏及其程度有关［12］。在体外和体内激活素A拮抗剂研究中证实了激活素A不仅对破骨细胞有促进作用，更重要的是对成骨细胞有抑制作用。人源化的激活素A拮抗剂 Sotatercept的临床试验显示，抑制激活素A能够促进成骨过程［21］。

大部分MM由MGUS演变而来［22］。在MM发病过程中，骨髓瘤细胞、骨髓基质细胞（BMSCs）及T淋巴细胞等细胞分泌的细胞因子组成的复杂肿瘤微环境与MM发病和病情进展密不可分。DAS 等［3］在动物实验研究中发现，MGUS演变至晚期的难治复发MM（RRMM）过程中，肿瘤微环境的免疫监视和外在对肿瘤的生长抑制逐渐减弱，肿瘤细胞呈现微环境依赖性生长。

本研究显示MM病情进展及肾病、贫血的发生同时伴随VCAM-1与激活素A水平升高，两者呈正相关。在MM骨髓微环境中，不同细胞亚型之间存在恒定的串扰。BMSCs是高水平VCAM-1和激活素A情况下产生的细胞，MM-BMSCs直接接触是诱发激活素A分泌的必要条件，此过程中，MM细胞通过极晚期抗原（VLA）-4/VCAM-1轴引发MM-BMSCs，骨髓微环境发生显著变化，VCAM-1与激活素A等细胞因子分泌增多，促进MM增殖和骨破坏，导致MM病情的进展及骨病等的发生［23］。激活素A可能通过Smad2与c-fos结合和激活的活化T淋巴细胞的核因子c1（NFATc1）参与MM骨病等病理过程［15］，VCAM-1可能通过整合素α4β1（VLA-4，极晚期抗原-4）/ VCAM-1轴、JAK/STAT1、PI3K/Akt/NF-κB 信号转导引起肿瘤发生和转移［5］。

总之，在MM肿瘤微循环中，升高的血清VCAM-1和激活素A水平可能与MM患者的发病或疾病进展有关，且可能参与MM肾病、与贫血或骨病等活动性症状的病理过程。故可能有希望成为未来新型的抗MM治疗靶点，进一步改善MM患者的生存质量。

作者贡献：王岩负责试验操作、数据收集、统计分析和论文撰写；黄仲夏负责研究设计、论文的质控和修改，对文章整体负责；胡婉莉、魏宇君和王林月参与了数据统计分析和患者随访工作。

本文无利益冲突。