膈下逐瘀汤加减方对气滞血瘀型输卵管炎性不孕模型大鼠DA、NE表达的影响

程英龙，马晓荣，胡喜姣，刘丽

(1.黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040；2.黑龙江中医药大学附属第一医院，黑龙江 哈尔滨 150040)

衣原体感染和淋病等性传播疾病都有导致盆腔炎性疾病和不孕症的可能性[1]。截止到2013年全球不孕症的患病率达到15%，我国不孕症的发病率也有逐年上升的趋势[2]。其中输卵管性不孕占不孕女性的30%～40%[3-4]。不孕症作为生活的一个负性事件严重影响着患者及家属的身心健康，甚至成为对家庭稳定具有极大威胁的因素。不孕症的治疗在临床上取得了较好的疗效，这其中包括西医的辅助生殖技术、宫腹腔镜等手术治疗手段，因其存在一定的局限性很难在临床治疗中推广普及。课题组前期实验研究证明了GD可以明显改善患者的IL-2、IL-6、TNF-α等炎性因子的表达水平，从而对输卵管炎性不孕症起到积极的治疗作用[5-7]。现在原课题的研究结果基础上，通过观察GD对模型大鼠中医证候评分、血流变、DA和NE的表达水平、输卵管病理表现及输卵管组织形态来探讨GD治疗气滞血瘀型输卵管炎性不孕症的作用机制。

1 材料

1.1 实验动物

SPF级雌性SD大鼠100只，鼠龄56～84 d，体质量(200±20)g，实验大鼠均来源于黑龙江中医药大学实验动物中心，编号:SCXK(黑) 2015-004。将大鼠饲养于黑龙江中医药大学实验动物中心，温度为20～22 ℃，相对湿度保持在40%左右，8:00—20:00人工照明12 h，分笼饲养，5只/笼，标准喂养饲料，自由饮水。

1.2 试剂与药品

金黄色葡萄球菌：菌号FSCC223005，浓度为4×109/mL，北京东方赛瑞生物技术有限公司；DA、NE酶联免疫试剂盒，南京建成生物工程研究所有限公司；水合氯醛、乌拉坦：上海山浦化工有限公司；膈下逐瘀汤加减方：延胡索、赤芍各20 g，牡丹皮、桃仁、川芎、枳壳、香附、乌药、地龙、鳖甲各15 g(草药均由黑龙江中医药大学中草药局提供，药品制备：以上饮片，按比例水煎煮，10倍量水一煎，8倍量水二煎，合并两煎药液， 水煎液浓缩适当浓度移至蒸发皿中，最后移至真空干燥箱中干燥至衡重，得膈下逐瘀加减方水煎液干粉以保证药物的稳定性)。

1.3 实验仪器

SGD-1声、光、电刺激仪(中国中医科学院西苑医院基础研究室研制)；KDC-16HR高速低温离心机(科大创新股份有限公司)；LBY-N6 Compact全自动血液流变仪(北京普利生仪器有限公司)；透射电镜(JEM-1220，日本电子有限公司)；光学显微镜(CX41，日本OLYMPUS公司)。

2 实验方法

2.1 实验分组

适应性喂养7 d后，将100只SD大鼠随机分为空白组(K)、病证结合组(B)、膈下逐瘀汤高剂量组(H)、膈下逐瘀汤中剂量组(M)、膈下逐瘀汤低剂量组(L)，每组20只。

2.2 模型制备及干预

实验第1天，K组不予处理，B组及H、M、L组进行手术造模。将10%水合氯醛按0.4 mL/100 g对大鼠进行腹腔注射麻醉，术区备皮，常规消毒后取近脊柱侧肋缘过肾区约5 mm处，开长约1 cm左右横切口，开腹后剥离周围组织，暴露子宫、输卵管及卵巢，然后向输卵管-卵巢方向注入金黄色葡萄球菌悬液0.1 mL，术毕逐层关腹，再次进行术区消毒。对侧输卵管操作同上。疾病造模后恢复7 d，开始制备气滞血瘀证候模型，给予B组、H、M及L组大鼠声、光、电+夹尾刺激，连续刺激21 d。具体刺激方法为：大鼠足底电击刺激，电击强度为25～35 V，每次持续电击时间为1 min；噪声刺激5～15 kHz，噪音刺激每次持续1 min；闪烁光刺激：以1～3 kHz的强度给予大鼠刺激，每次刺激持续时间为1 min，声、光、电刺激均是每间隔15 min刺激1次。应用以上3种刺激方法对大鼠进行循环刺激，共刺激10 h/d；夹尾:1次/h，每次刺激时间为4 min，8次/d。药物干预方法：治疗组分别按膈下逐瘀汤加减方高、中、低剂量组分别给予模型大鼠灌胃膈下逐瘀汤加减方水煎液浓缩干粉，加水制成相当于高剂量1.50 g/mL，中剂量0.75 g/mL，低剂量0.38 g/mL的混悬液；大鼠灌胃剂量按照0.02 mL/g鼠质量给药。模型对照组灌服等剂量蒸馏水，在造模第29天开始，每日上午9:00行灌胃1次，连续给药4周。

2.3 取材方法及检测指标

实验给药治疗28 d后，大鼠禁食不禁水12 h，次日9:00用20%乌拉坦(1 mL/100 g)对大鼠进行腹腔注射麻醉后，行腹主动脉采血，一部分血样用于测定血流变各项指标，余下血样静置4 h( 温度为4 ℃)，按4 000 r/min低温离心10 min后取其血清，按照酶连免疫法试剂盒说明书进行DA、NE含量测定。取模型大鼠双侧输卵管组织，行HE染色制备病例切片及进行电镜观察输卵管组织形态。

2.4 数据统计与分析

3 实验结果

3.1 GD对模型大鼠中医证候积分的影响

与K组相比，B组中医证候积分有显著差异(P<0.01)，表明模型制备成功。

与B组相比较，H、M组中医证候积分有统计学差异(P<0.05)，说明高、中浓度GD均能明显降低模型大鼠的气滞血瘀证候评分。见表1。

表1 气滞血瘀证候总积分

3.2 GD对模型大鼠血流变指标影响

与K组相比，B组的血浆黏度、全血黏度30及还原黏度3.0均极显著升高，P<0.01；与B相比，H、M两组全血黏度30、血浆黏度和还原黏度3.0下降极其显著，P<0.01，L组能明显下调还原黏度3.0，P<0.05，血浆黏度、全血黏度3.0下降极其显著，P<0.01。见表2。

表2 GD对大鼠血浆黏度、全血黏度3.0、还原黏度3.0的影响

3.3 GD对模型大鼠DA、NE表达的影响

与K组相比，B组DA、NE表达水平均有显著差异(P<0.05)；与B组比较，H、M组的DA、NE差异现显著(P<0.05)。见表3。

表3 GD对大鼠血清DA、NE表达的影响

3.4 GD对模型大鼠输卵管病理学影响

B组大鼠输卵管细胞排列较紊乱，胞体肿胀，部分细胞核肿胀，细胞黏连充血；H组：输卵管管腔上皮轻度脱落，输卵管周围可见少量炎细胞；M组：输卵管管腔内可见渗出液，输卵管周围大量炎细胞，胞体轻度肿胀；L组：输卵管管腔少量炎细胞，上皮细胞脱落，部分坏死，输卵管周围少量炎细胞，胞体肿胀明显。见图1。

3.5 电镜观察GD对模型大鼠输卵管病变的影响

K组：输卵管组织形态完好，无明显实质性变性、坏死，纤毛丰富，输卵管管腔无狭窄，无结缔组织增生及炎细胞浸润。B组：大鼠输卵管均呈现不同程度的病态组织形态，4例较为严重。

H、M、L三组(其余各治疗组)：输卵管组织形态均有着不同程度的改善作用。见表4。

注：K.空白组;B.病证结合组;H.GD高剂量组;M.GD中剂量组;L.GD低剂量组。图1 各组大鼠输卵管HE染色图(×400)

表4 电镜观察输卵管组织形态学结果

4 讨论

“气滞血瘀证”是输卵管炎性不孕最为常见的证型[8]。因此课题组对气滞血瘀型输卵管炎性不孕症作为重点研究。本研究所用方剂是在膈下逐瘀汤原方的基础上去五灵脂、红花、当归、甘草，加地龙、鳖甲二味而成膈下逐瘀汤加减方。方中牡丹皮可凉血活血，为君药，配以乌药，有补有泄。赤芍止痛散瘀、清热凉血，是为臣。 鳖甲软坚散结，与牡丹皮、桃仁相配，可化瘀除癥，通管腔之塞物；川芎配伍枳壳，活血、行气、消瘀滞；地龙配川芎，活络通经；延胡索、香附、乌药皆入肝经，共奏开郁行气、散结止痛之功。刘师应用该方并以“活血化瘀，行气止痛”为法，在临床治疗输卵管炎性不孕时，疗效颇佳。课题组前期研究表明GD可以明显改善患者的IL-2、IL-6、TNF-α等炎性因子的表达水平，减少对输卵管损伤，发挥其抗炎、抑制输卵管黏连及纤维化，从而对输卵管炎不孕症起到积极的治疗作用。本实验旨在通过观察GD对模型大鼠中医证候评分、血流变、DA和NE的表达水平、输卵管病理表现及输卵管组织形态来探讨GD治疗气滞血瘀型输卵管炎性不孕症的作用机制。

血流变[9]在中医血瘀证诊断标准中是一项重要内容。因此，血液流变学是可以作为药物对血瘀证改善程度的一项客观指标[10]。本研究结果显示，高、中、低剂量的GD均能够在不同程度上改善模型大鼠血流变学指标。这从血液流变学角度证实了GD能够改善模型大鼠的“血瘀”状态。单胺类神经递质是中枢神经递质，其所代谢的产物对神经、内分泌等系统均具有调节作用，并且对情绪、睡眠觉醒等生理活动产生着重要的影响[11]。DA表达的降低会引起意志活动的减少，情感淡漠等情志异常问题，同时也会影响5-HT神经能元及其通路，进而引起抑郁的发生，NE亦是导致抑郁的一个重要介质[12]。有研究表明[13-14]DA、NE与肝郁气滞证关系十分密切。《景岳全书·妇人规》载曰:“产育由于气血，气血由于情怀，情怀不畅，则冲任不充，冲任不充则胎孕不受。”中医学认为情志与肝的关系最为密切，冲、任、督三脉皆起于胞宫而通于肝，故肝、冲任督脉、胞宫关系密切相关。正所谓“思虑无穷，皆难得子”，可见不良的情绪刺激，会产生恶性循环，加重不孕病情。因此对不孕妇女情志的调节是该病在治疗过程中不可忽视的一部分。而在中枢神经系统中，NE、DA具有调节情绪的生理功能，并且DA是 NE 的前体，参与着心理应激活动以及精神情绪活动，当DA、NE表达异常时，就会出现情绪的异常。在本研究中，病证结合组的 DA、NE含量较正常组明显下降，提示模型大鼠存在肝郁气滞，高、中剂量组的膈下逐瘀汤能够明显升高 DA、NE 含量，从而改善大鼠了“肝郁”状态，这都客观证实了GD具有疏肝行气作用，可以改善大鼠的“气滞血瘀”证候。另一方面，从组织病理学来看，慢性输卵管炎的病理表现形式包括慢性间质性输卵管炎、输卵管积水以及输卵管积脓等，具体可见输卵管壁间结缔组织增生纤维化，管壁增厚或变硬，输卵管及周边组织黏连，输卵管腔内积水、积脓等[15]。久之，导致输卵管纤维化，输卵管僵硬变形，导致妇女不孕。因此，在本研究中，我们着重从光镜、电镜等不同角度观察GD对模型大鼠输卵管组织形态以及病理学方面的影响，更进一步证实了GD的有效性。

综上可见，GD通过改善模型大鼠中医证候积分、血流变、DA与NE的表达、输卵管病理表现及输卵管组织形态，对气滞血瘀型输卵管炎性不孕症起到积极的治疗作用。