黄芩汤对UC模型大鼠PINK1/Parkin通路的作用研究

苗金雪，马旭冉，冯雪，李晗，王岚，高曦，张良，宋红新，王敦方，刘雅清，李佳，杨伟鹏，*

(1.黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040；2.中国中医科学院中药研究所，北京 100700；3.清华大学，北京 100083)

溃疡性结肠炎(ulcerative colitis，UC)是一种慢性炎症性疾病，好发于中青年，临床表现为持续或反复发作的腹泻、黏液脓血便伴腹痛、里急后重和不同程度的全身症状，病程多在4～6周以上[1]，严重影响患者生活质量。黄芩汤源于张仲景的《伤寒论》，由黄芩、芍药、大枣及甘草4味药组成，其主治为“自下利”，具有清热止痢、和中降逆的功效，被历代医家奉为治痢祖方，在临床上被广泛应用于溃疡性结肠炎及结肠癌等消化系统疾病。近年来，课题组一直致力于对黄芩汤的研究。有研究表明，人前梯度蛋白2(anterior gradient-2,AGR2) 基因可抑制肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α) 诱导的肠黏膜屏障损伤，保护线粒体功能，这种保护作用可能是通过诱导线粒体自噬发生实现的[2]；自噬可通过调节肠道菌群和黏液分泌来维持肠道内稳态，达到减轻UC的作用[3]。临床上也有案例表明溃疡性结肠炎患者结肠组织中存在线粒体自噬现象，且其主要通路蛋白PINK1与Parkin的表达量也存在差异,推测PINK1/Parkin介导的线粒体自噬可能是溃疡性结肠炎的潜在保护机制[4]。本实验拟从黄芩汤对PINK1和Parkin蛋白表达的影响入手，探究黄芩汤对溃疡性结肠炎大鼠结肠组织中线粒体自噬的影响。

1 实验材料与研究方法

1.1 动物

SPF级健康SD大鼠，雄性，体质量(190±10)g，购于北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号SCXK(京)2016-0011。动物饲养于中国中医科学院中药研究所清洁级动物房，温度为(22±2.5)℃，湿度为(40±20)%。

1.2 药品与试剂

黄芩(ScutellariabaicalensisGeorgi)、芍药(PaeonialactifloraPall)、炙甘草(GlycyrrhizauralensisFisch)和大枣(ZiziphusjujubaMill)饮片均购于北京华邈药业有限公司，经鉴定为合格药材。黄芩汤煎剂按照文献方法制得[5]。2,4,6-三硝基苯磺酸(2,4,6-trinitro-Benzenesulfonic acid ,TNBS,美国sigma公司)；柳氮磺胺吡啶肠溶片(salazosulfapyridine，SASP，批号：09200506，上海信谊天平药业有限公司)；兔抗鼠PINK1单克隆抗体、兔抗鼠Parkin单克隆抗体(美国CST公司，货号分别为6946T、2132S)。

1.3 实验仪器

电泳仪(美国Bio-Rad公司);摇床(海门市其林贝尔仪器制造有限公司);发光仪(Clinx Science Instruments);CKX41 OLYMPUS倒置显微镜(日本奥林巴斯公司);涡旋混合器(海门市其林贝尔仪器制造公司);电热鼓风干燥箱(上海一恒科学仪器有限公司);HH系列数显恒温水浴锅(金坛市科仪器有限公司)。

1.4 造模方法

采用Morris等[6]文献报道的造模方法制备UC大鼠模型，在适应性饲养5 d后，禁食不禁水24 h，大鼠腹腔注射1%的戊巴比妥钠(40～60 mg/kg)进行麻醉,然后将TNBS混合溶剂(TNBS 0.18 mL/100 g+50%乙醇 0.25 mL)注入大鼠肛门内约8 cm处，然后立刻将大鼠倒置，捏紧肛门，防止溶剂流出。正常组麻醉后给予同体积的生理盐水，后续操作与造模大鼠相同。造模结束约3 h后大鼠陆续开始恢复意识，术后进行常规饲养。

1.5 实验分组及样本的采集

大鼠按照体质量随机分为6组，分别为正常组、模型组、阳性药SASP组(为0.5 g/kg)和黄芩汤高、中、低剂量组(20 、10、5 g/kg)。造模后第4天开始灌胃给药，模型组给予等体积的生理盐水，每日1次，连续给药7 d。末次给药后，大鼠禁食不禁水24 h，然后进行眼眶取血，注意小心操作，避免溶血，所取得的大鼠血液以3 000 r/min离心15 min后，吸取分离上层血清，冷冻于-20 ℃备用。取血后脱颈处死大鼠，解剖取出结肠组织，生理盐水清洗肠道内容物，将肠段分为3部分，一部分冻存于-80 ℃备用，一部分用10%多聚甲醛固定，留作后续的病理切片及HE染色，一部分用4%的戊二醛固定，4 ℃保存，留作电镜观察。

2 检测指标及方法

2.1 行为学指标

观察造模前后及给药前后的大鼠精神状态、行为体征、粪便性状，记录其进食量及体质量，按UC活动指数(DAI)评分标准[7]进行评分，评分标准如下：体质量无下降，大便性状正常，无便血，记0分；体质量下降<5%，大便略松散，有隐性出血，记1分；体质量下降<10%，大便松散，肉眼可见出血，记2分；体质量下降≥10%，腹泻，血便，记3分。

2.2 病理学指标

高倍镜下观察各组大鼠结肠组织形态。取甲醛固定好的结肠组织，进行包埋、切片、HE染色，高倍镜下选取视野，根据病变损伤程度进行评分，评分标准[8]如下：未见明显损伤，记0分；10%高倍镜视野中呈低水平淋巴细胞浸润，肠绒毛结构无破坏，记1分；10%～25%高倍镜视野中呈中等水平淋巴细胞浸润，肠隐窝加深，肠壁增厚单位侵及肌层，无溃疡，记2分；25%～50%高倍镜视野中呈高水平淋巴细胞浸润，血管增生，肠壁增厚且侵及肌层，无溃疡，记3分；明显的淋巴细胞浸润，血管增生，肠隐窝加深变形，肠壁增厚且侵及肌层，伴溃疡，记4分。

2.3 黄芩汤对大鼠结肠组织中线粒体自噬的影响

将固定在4%戊二醛中的结肠组织进行切片、固定、梯度脱水、包埋、固化、切成超薄片、醋酸铀和枸橼酸铅双染色，进行透射电镜观察和拍照。

2.4 黄芩汤对大鼠结肠中PINK1、Parkin表达的影响

将大鼠的结肠组织充分裂解后提取总蛋白， BCA试剂盒检测组织中的蛋白浓度，按照所得浓度以不同比例加入蛋白上样缓冲液，蛋白样品变性，电泳分离，转膜，封闭，TBST洗膜，加入PINK1和Parkin抗体，4 ℃反应过夜后二次洗涤，加入相应的二抗并在室温下孵育2 h，再次洗涤后加入发光液曝光，图片扫描，分析条带灰度值。

2.5 统计学方法

3 结果

3.1 行为学指标

造模后的大鼠出现不同程度的精神萎靡，倦怠嗜卧，被毛蓬乱无光泽，食欲下降，体质量减轻，粪便不成形，个别大鼠出现脓血便。在给药7 d后，各给药组的体质量及食量与模型组相比均有不同程度的增加，尤其以SASP组和黄芩汤中剂量组改善明显，模型组并未出现明显好转。大鼠DAI评分见表1,进食量及体质量统计结果见图1、2。

表1 各组大鼠造模后DAI评分分)

图1 黄芩汤对UC大鼠体质量的影响

图2 黄芩汤对UC大鼠进食量的影响

3.2 病理学指标

肉眼观察UC大鼠的结肠组织，正常组结肠组织外观正常，颜色正常，未见充血，浆膜面、黏膜面及肌层未见明显病变，模型组大鼠结肠组织存在充血现象，外观颜色发生改变，呈现红褐色，肠黏膜及肌层明显变薄，个别大鼠结肠与周边组织发生黏连，并伴有恶臭味，阳性药SASP组未见明显的充血现象，病变程度减轻，黄芩汤3个剂量组大鼠结肠组织外观颜色、充血及肌层厚度等与模型组相比均有不同程度的改善，见图3。HE染色结果见图4，结肠组织病理评分结果见表2。

图3 各组大鼠结肠组织对比

注:A：正常组;B:模型组;C：阳性药SASP组;D：高剂量组;E：中剂量组;F：低剂量组。图4 各组大鼠结肠组织病理切片(100×)

表2 各组大鼠结肠组织病理学评分分)

镜下观察结肠组织：正常组大鼠结肠黏膜完整，绒毛排列整齐，未见坏死、脱落，肌层结构正常。模型组大鼠明显可见炎细胞浸润，结构腺体消失，杯状细胞明显减少，肠绒毛肿胀而短小，黏连成片甚至缺失，黏膜层变薄。黄芩汤三个剂量组与模型组相比结肠黏膜炎性细胞浸润数量明显减少，肠壁结构紊乱程度减轻，病理变化得到不同程度的改善，其中以黄芩汤中剂量组最为明显。

3.3 黄芩汤对大鼠结肠组织线粒体自噬的影响

透射电镜下观察线粒体的超微结构，正常组线粒体形态结构正常，体积正常，线粒体嵴结构完整，边缘整齐。而模型组可观察到线粒体肿胀，体积增大，嵴变短并且边移，基质颗粒减少，可观察到空化现象。各给药组也可观察到不同程度的线粒体结构损伤及自噬现象的发生，可见自噬小体与自噬溶酶体。结果见图5。

注:A：正常组;B:模型组;C：阳性药SASP组;D：高剂量组;E：中剂量组;F：低剂量组。图5 黄芩汤对UC大鼠结肠组织中线粒体自噬的影响

3.4 黄芩汤对UC大鼠结肠组织中PINK1/Parkin蛋白表达的影响

Western blot结果如图6和图7所示。UC模型组大鼠结肠组织中Parkin蛋白的表达量低于正常组(P<0.01)，阳性药组与黄芩汤各剂量组中PINK1与Parkin的表达量均有不同程度的升高，提示给药后大鼠的线粒体自噬强度增强，结果可见表3。模型组中PINK1蛋白表达量较正常组增加，其可能原因为线粒体损伤后该蛋白无法进入线粒体内被降解，大量聚集在线粒体外膜。

注：A：正常组;B:模型组;C：阳性药组;D：高剂量组;E：中剂量组;F：低剂量组;与正常组比较，△P<0.05,△△P<0.01；与模型组比较，*P<0.05,**P<0.01。图6 黄芩汤对结肠组织中PINK1表达量的影响

注：A：正常组;B:模型组;C：阳性药组;D：高剂量组;E：中剂量组;F：低剂量组;与正常组比较，△P<0.05, △△P<0.01；与模型组比较，*P<0.05,**P<0.01。图7 黄芩汤对结肠组织Parkin表达量的影响

表3 黄芩汤对UC大鼠组织中PINK1和Parkin蛋白表达的影响

4 讨论

线粒体在细胞的生命活动过程中起着至关重要的作用，它不仅能为细胞的生命活动提供能量与生物合成的底物，还可以清除掉胞内损伤或衰老的细胞器及线粒体受损时产生的过量线粒体反应活性氧类(mitochondrial reactive oxygen species，mtROS)，减轻线粒体损伤对细胞的伤害，维持线粒体内的动态平衡，保障生命活动的顺利进行，这一过程被称为线粒体自噬。同时，线粒体还是固有免疫反应最基本的信号平台之一[9]，在调节细胞对应激源的适应中起着至关重要的作用，包括受损的生物发生、线粒体DNA损伤、衰老、营养限制以及分裂与融合之间的平衡失常，如果不加以控制，这些过程会通过活性氧对核酸、脂质和蛋白质造成损伤，导致持续的氧化应激，氧化应激通过转录后修饰(包括泛素化)来调节线粒体动力学，这反过来又导致受损的线粒体的聚集，最终导致细胞死亡和更广泛的组织功能障碍[10]，从而导致多种疾病的发生。另一方面，线粒体自噬与炎症似乎也有着密切的联系，线粒体ROS可通过激活核转录因子、腺苷酸活化蛋白激酶、一氧化氮合成酶等转录因子，共同参与炎症调控[11]，在炎症过程中，线粒体既是ROS的重要来源，又是其损伤靶点，二者交互作用，形成恶性循环，共同调控机体炎性反应[12]。课题组前期研究发现，黄芩汤可以发挥抗氧化应激作用[13]，减少细胞内过氧化产物的累积，并且能够抑制细胞炎性因子的表达[14-15]，据此提出假设，黄芩汤能够缓解溃疡性结肠炎大鼠的氧化应激反应可能与调控线粒体的自噬水平有关。

PINK1/Parkin通路是目前研究较多的线粒体自噬通路，其表达量在一定程度上反映了线粒体自噬的水平。有研究证实，PINK1和Parkin蛋白可以通过清除受损线粒体来预防炎症[16-17]。PINK1是一种有581个氨基酸的丝氨酸/苏氨酸激酶，在正常生理状态的线粒体中，PINK1会不断地被转移至线粒体内膜，被线粒体内膜蛋白酶切割清除，因此，正常情况下PINK1在细胞中保持着较低水平。Parkin是一种具有465个氨基酸的E3泛素连接酶，具有连接酶活性。在机体受到应激源刺激时，线粒体膜电位发生去极化，氧化呼吸异常，产生大量ROS引起线粒体氧化损伤，PINK1进入线粒体的路径被阻断，聚集于线粒体外膜，并将Parkin募集至线粒体[18]，构建多聚泛素链泛素化线粒体相关成分蛋白与自噬受体蛋白结合，同时，受体蛋白的LIR(LC3相互作用区域)与锚定于自噬囊泡上的微管相关蛋白轻链3(microtublue associated protein light chain 3,LC3)结合，构成线粒体自噬体，而后与溶酶体结合成线粒体自噬溶酶体，最终被水解酶水解[19]。因此当线粒体稳态遭到破坏时，PINK1在组织中大量聚集，这与实验结果中Western Blot法检测到模型组大鼠组织中PINK1蛋白的表达量增多的现象符合，线粒体自噬启动时，PINK1蛋白会聚集Parkin蛋白于线粒体外模上，导致组织中的Parkin表达量增多。综上所述，黄芩汤可以促进溃疡性结肠炎大鼠组织中PINK1和Parkin蛋白表达。

本次实验通过对PINK1/Parkin自噬通路相关位点蛋白的检测，探究黄芩汤对UC大鼠组织中线粒体自噬的影响。实验结果显示，黄芩汤可以明显改善UC模型大鼠的体征及DAI评分，电镜观察到各给药组大鼠组织中自噬小泡与溶酶体等线粒体自噬结构，说明组织中发生了线粒体自噬，并且PINK1与Parkin的表达量明显增加，说明给药后大鼠结肠组织中PINK1/Parkin自噬通路被激活，启动线粒体自噬，提示黄芩汤可能通过影响PINK1和Parkin蛋白的表达，激活线粒体自噬，清除组织内受损的线粒体，从而达到治疗溃疡性结肠炎的效果。