肺腺癌miR-195的表达及靶基因筛选*

罗 裕，潘民主，莫慧慧，区莹莹，明火清，韦 想，黄 荣，杨日荣

1．广西壮族自治区人民医院检验科，广西南宁 530021；2．广西医科大学第一临床医学院，广西南宁 530021；3．广西医科大学基础医学院免疫学教研室，广西南宁 530021

肺癌是常见的恶性肿瘤之一，其发生、发展是多因素的过程，涉及较多基因与蛋白[1]。而微小RNA(miRNA)作为单链非编码RNA，广泛存在于真核生物体内，其通过与靶基因的mRNA 3′-非翻译区(3′UTR)结合，降解mRNA或抑制其翻译，调控多种细胞的功能[2-3]。miRNA失调对许多癌症有影响，如结直肠癌、乳腺癌、宫颈癌、胃癌、肝细胞癌及前列腺癌等[4-8]。本研究通过检测肺腺癌中miR-195的表达，研究miR-195靶基因间的相互联系，分析靶基因的生存预后，以探讨其在肺腺癌中的作用，为肺腺癌研究提供新的思路。

1 资料与方法

1.1一般资料 收集广西壮族自治区人民医院11例临床肺腺癌患者的标本，包括癌组织与癌旁正常组织，标本离体后在最短时间内将癌组织及癌旁正常组织切成直径0.5 cm的小块，分别装入已编号的灭菌冻存管中，迅速放入液氮转移罐，做好长期保存准备。标本存放好后，登记标本编号、住院号、肿瘤类型、取材数量。本研究通过广西壮族自治区人民医院伦理委员会的批准，并在患者知情同意情况下进行标本收集。

1.2方法

1.2.1实时荧光定量PCR检测miR-195在临床标本中的表达 取约0.1 g组织标本放入冰预冷的含1.5 mL RNA裂解液的匀浆器中，进行总RNA提取。反转录取2 μg的RNA、3 μL随机引物，补DEPC水至24 μL，放入PCR仪中。70 ℃热变性15 min，迅速冰浴3 min。按照说明书加入其他试剂，每管液体总体积约40 μL，将混合物短暂离心后置于PCR仪中，37 ℃ 90 min；向每管PCR产物中加入60.0 mL超纯水稀释。进行实时荧光定量PCR，并取PCR产物进行凝胶电泳检测。

1.2.2细胞培养及总RNA提取 使用含10%胎牛血清的DMEM培养基，肺腺癌A549细胞在CO2浓度为5%、饱和湿度、温度为37 ℃的恒温细胞培养箱中进行培养。取生长汇合度90%的A549细胞，PBS洗涤2次，加入1.0 mL的Trizol试剂，裂解细胞。室温静置5 min后加入200 μL氯仿剧烈震荡30 s，室温静置3 min，4 ℃预冷离心机，12 000 r/min离心5 min。吸取上清液转移至离心管，加入异丙醇，于-20 ℃冰箱放置2 h以上。取出标本，用4 ℃预冷高速离心机12 000 r/min离心30 min，去除上清液，保留的沉淀物中加入1.0 mL 70%的预冷乙醇，颠倒洗涤，4 ℃，12 000 r/min离心10 min，去上清液后得到总RNA。

1.2.3目的片段的筛选及测序 利用引物设计软件OLIGO(V7)进行miR-195的Hybrid PCR设计。将纯化后的Hybrid PCR产物与T载体连接，按照美国Promega公司T-Easy载体试剂盒说明书进行操作。将连接产物加至感受态细胞中，冰浴30 min，42 ℃水浴热击90 s。快速冷却2 min。加入培养基混匀，振荡培养1 h，取菌液涂布于平板上，倒置平板37 ℃过夜培养。在转化的蓝白斑平板中挑选白色菌落进行菌落PCR。检测500个菌落，然后取PCR产物进行凝胶电泳检测，根据电泳结果，挑选片段大小不一的阳性片段相对应的阳性克隆菌过夜摇菌培养，取菌液与甘油混合送至上海生工生物工程有限公司进行测序。

1.2.4生物信息学分析 在获得miR-195候选靶基因的测序序列后，在美国国家生物信息中心网站上进行核酸比对及基因注释，并利用miRanda、TargetScan、RNA Hybrid等软件分析miR-195与候选靶基因的作用，使用GeneMANIA网站(http://www.genemania.org/)，构建候选靶基因作用网络图谱，最后采用生存预后网站(http://gepia2.cancer-pku.cn/)进行Kaplan-Meier生存分析。

2 结 果

2.1miR-195在肺腺癌组织中的表达 在TCGA数据库下载到肺腺癌组织标本数据，包括癌组织519例及癌旁正常组织46例。在癌组织中miR-195的相对表达水平低于癌旁正常组织，差异有统计学意义(P<0.01)，见图1A。收集11例临床肺腺癌患者的癌组织与癌旁正常组织标本，分别检测miR-195的相对表达水平，结果显示，miR-195在癌组织的相对表达水平低于癌旁正常组织，差异有统计学意义(P<0.01)，见图1B。

2.2miR-195靶基因的筛选 根据Hybrid PCR结合序列匹配的基本原则，设计miR-195互补引物，进行PCR，结果显示miR-195的Hybrid PCR产物有多条DNA条带，见图2A。通过蓝白斑筛选出约500个白色菌落进行菌落PCR，琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，结果显示不同大小的条带，见图2B。挑选96个不同大小片段的T载体进行测序，得到19个不同序列。对测序得到的不同长度DNA 序列进行核酸序列比对，并进行基因注释，结果见表1。

注：A表示TCGA数据库肺腺癌标本miR-195的相对表达水平；B表示临床肺腺癌标本miR-195的相对表达水平。

注：A表示琼脂糖凝胶电泳检测Hybrid PCR产物；B表示菌落PCR产物。

2.3肺腺癌miR-195靶基因结合位点分析及作用网络构建 利用生物信息学软件对肺腺癌miR-195靶基因的结合位点进行分析显示，miR-195结合位点在靶基因 3′UTR 上有19个，见表1。根据miRNA种子序列完全匹配原则，与 miR-195种子序列完全匹配的有19个靶基因，分别为ATP6V1B2、M6PR、GCLC0、TNIP2、NOB1、SUMO3、FOPNL、IPO7、GDI2、CREG1、RRAGA、MAFK、CEACAM6、SELENBP1、THRAP3、CYBRD、ANKIB1、PPT1、FDFT1，见图3。再利用GeneMANIA网站(http://www.genemania.org/)分析上述靶基因，得到作用网络及靶基因间的关系，结果显示，靶基因SUMO3与IPO7之间有直接的相互作用，见图4。

2.4靶基因生存预后分析 利用TCGA数据库，对miR-195的靶基因进行生存预后分析，Kaplan-Meier 生存曲线结果显示，与高表达患者相比，低表达GCLC、NOB1的患者预后较好(P<0.05)，见图5。

图3 肺腺癌 miR-195靶基因结合位点分析

图4 候选靶基因作用网络构建图

表1 肺腺癌 miR-195靶基因序列比对及基因注释

注：A、B分别为GCLC、NOB1生存曲线。

3 讨 论

肺腺癌是对人类的健康与生命威胁最大的恶性肿瘤之一，其发病率正在逐年上升[1]。越来越多的研究结果显示，肺腺癌的发生、发展是多种环境因素影响、细胞自身多种基因失活或基因过度激活共同作用的结果。研究发现，肺腺癌常见的基因变异有表皮生长因子受体、Kirsten鼠肉瘤病毒基因等，不同的基因变异型患者存在不同的治疗靶点[9]。miR-195作为影响癌症的重要因子可以通过下调碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)，抑制SNU-1和KATO-3细胞的侵袭和转移，控制癌症的发展[10]。miR-195也可以通过调节SALL4来抑制胶质瘤的增殖和迁移[11]。研究显示，miR-497～miR-195团簇通过维持内皮细胞Notch和缺氧诱导因子1α(HIF-1α)活性来调节成骨过程中的血管生成[12]。同时，miR-195可以直接靶向CX3CL1/CX3CR1预防局灶性脑缺血[13]。本研究首先在TCGA数据库中下载得到肺腺癌的测序数据，比对癌旁正常组织与癌组织中miR-195的相对表达水平，发现miR-195在癌组织中相对表达水平低于癌旁正常组织。通过检测11例临床肺腺癌标本中miR-195的相对表达水平，发现相对于癌旁正常组织，癌组织中的miR-195表达下调，推测miR-195的相对表达水平与肺腺癌的发生具有相关性。为进一步了解miR-195调控肺腺癌的相关因素，笔者利用Hybrid PCR模拟miR-195与靶基因的结合，并利用菌落PCR筛选Hybrid PCR产物条带，发现miR-195对应多个靶基因。随后，进一步利用生物信息学方法筛选出miR-195在肺腺癌中的19个靶基因等。据报道，SUMO化修饰能够调节蛋白的稳定性，调控细胞周期、信号转导，维持基因组完整性[14]。本研究构建靶基因作用网络，结果发现SUMO3可以调控IPO7。有研究发现，miR-22可下调IPO7从而影响低氧诱导因子-1α的表达[15]。最后对靶基因进行生存分析，结果发现患者靶基因GCLC、NOB1低表达与肺腺癌良好预后相关。有报道称，GCLC和GCLM在外周T细胞淋巴瘤组织中高表达，可能参与肿瘤的发生、发展，且NOB1蛋白表达升高，细胞凋亡率会降低[16-17]。

综上所述，本研究结果揭示了肺腺癌中miR-195的功能及靶基因之间的相互关系，为肺腺癌的研究提供了有效依据。随着研究的深入，肺腺癌miR-195及其靶基因的调控网络将逐步清晰，miR-195有可能成为肺腺癌的一个新的标志物，但仍需要继续探索miR-195在肿瘤发生、发展中的具体作用机制，为肺腺癌的诊断、药物治疗、预后监测提供新的靶点。