SHP2在难治性肝细胞癌中的水平变化及作用

刘金菊，李钦勇

临沂市肿瘤医院内三科，山东临沂 276001

肝细胞癌可由慢性肝病和肝硬化发展而来[1-2]。尽管这种疾病可通过手术切除进行治疗，但由于肿瘤范围或潜在的肝功能不全，大多数患者不符合手术条件[3-4]。现阶段还可通过肝移植、经皮乙醇或乙酸消融、经动脉化疗栓塞等方法治疗，治疗方案的选择取决于疾病病程和潜在肝脏疾病的严重程度[4]。但由于手术切除后频繁复发及患者对常规化疗的反应较差，肝细胞癌长期生存情况并不理想。调查显示，每年肝细胞癌的病死与全球发病人数相似，这也突显了这种侵略性疾病的高病死率[5]。越来越多的证据显示，肝细胞癌的化学抗性、频繁复发均与肝细胞癌干细胞存在关联，因此，探讨肝细胞癌干细胞关联的分子机制可制订出更有效的治疗策略[6-8]。由PTPN11编码的含Src-homology 2结构域的磷酸酶SHP2是完全激活细胞外信号调节激酶所必需的，在细胞存活和生长中起正调节作用[9-10]。NEEL等[11]研究显示，有条件的SHP2消融可显著减弱部分肝切除术后细胞外信号调节激酶激活和肝脏再生。还有研究表明，肝细胞特异性SHP2消融增加胆汁酸分泌，这一过程促进相关蛋白的合成和肝细胞癌的发展[12]。本文主要研究难治性肝细胞癌中SHP2的水平变化及其对肝细胞癌干细胞扩增的影响。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1细胞株SMMC-7721裸鼠模型建立 人肝细胞癌细胞株SMMC-7721购自中国科学院典型培养物保藏中心。BALB/c-nu裸鼠，雌性，4～6周龄，体质量(16±3)g，购自上海斯莱克实验动物有限公司，许可证：SCXK(沪)2012-0002，SPF级饲养。在37 ℃、5% CO2条件下，DMEM培养基中培养SMMC-7721细胞。将对数生长期的SMMC-7721细胞胰酶消化、离心和计数后，用生理盐水制成细胞悬液。按2×105的剂量将细胞悬液接种于裸鼠背部皮下，约2周后分离肿块，将其切为0.1 cm3的立方体，接种于裸鼠右腋下，共16只。随机将裸鼠分为顺铂组和对照组，每组8只。放归饲养后，顺铂组裸鼠每隔1 d瘤内注射2 mg/kg顺铂，对照组以等体积磷酸盐缓冲盐水替代。期间观察第0、3、6、9天的肿瘤体积，测量长度和宽度。肿瘤体积(cm3)=1/2×长度×宽度2。喂养7周后处死裸鼠，完全切除富含顺铂耐药细胞的残留癌组织(顺铂组)和完整癌组织(对照组)。

1.1.2患者组织裸鼠模型建立 随机取本院就诊的2例难治性肝细胞癌患者肿瘤组织标本。将癌组织切成0.1 cm3的体积，并分别皮下接种裸鼠，1例患者的标本接种8只，分开饲养，其中4只裸鼠使用索拉非尼(购自德国Bayer公司)进行治疗，剂量30 mg/kg，列为索拉非尼1组(n=4)；另1例患者标本接种裸鼠后同样处理，列为索拉非尼2组(n=4)。其余8只使用等体积磷酸盐缓冲盐水替代索拉非尼，列为空白组1组(n=4)和空白2组(n=4)。难治性肝细胞癌纳入标准：初确诊时诊断为肝细胞癌，经穿刺活检病理确认；为复发疾病，或存在转移病灶；手术取样或有活检留样。本研究动物实验经本院伦理委员会批准且符合伦理学要求。

1.2方法

1.2.1引物序列和Western blot检测 计算肿瘤体积后，将一部分组织标本置于液氮中，进行实时荧光定量PCR和Western blot检测。使用ABI PRISM 7300序列检测器(Applied Biosystems)通过PCR确定特定转录本的原始量。使用IRDye 800CW偶联抗体和LI-COR成像系统通过Western blot分析肝细胞癌细胞的蛋白质提取物。SHP2(人)PCR上游引物序列：5′-CTG CCT CCA CAC CAG TGA TA-3′，下游引物序列：5′-GGA GCC TGA GCA AGG AGC-3′。 SHP2序列置乱：5′-GGA CTC AA-TTT GTG AGA AT-3′。SHP2抗体(兔多克隆抗体)购自Abcam公司(中国，ab17940)。

1.2.2肝细胞癌干细胞中SHP2相对表达水平的检测 人肝细胞癌细胞株于37 ℃、5 % CO2条件下培养，贴壁细胞80%密度时除去培养基，胰蛋白酶消化。消化完成后加入新鲜培养基，按1∶4进行传代培养。待80%贴壁细胞从培养瓶壁完全消化下来后，离心收集细胞，缓冲液洗涤后加入无血清含双抗培养基培养。待悬浮细胞长至70～80 nm稳定传代肝细胞癌干细胞。选择肝细胞癌细胞株SMMC-7721、LM3、HepG2和Huh7按照上述方法培养，PCR检测SHP2的相对表达水平，以培养的贴壁细胞作为对照。上述细胞株均购自中国科学院典型培养物保藏中心。相对表达水平采用2-ΔΔCt计算。

1.2.3SHP2对肝细胞癌干细胞扩增的影响 表达SHP2的腺病毒购自Vigene Bioscience公司(中国)。SMMC-7721 shSHP2稳定细胞株使用表达shSHP2的慢病毒构建，RNA序列置乱作为对照组。在96孔培养板中培养肝细胞7 d，在显微镜下计数。将原代肝细胞癌的单细胞悬液接种在6孔超低附着培养板中，并感染Lenti-shSHP2和对照。使用体外有限稀释法比较SMMC-7721、LM3细胞株Lenti-shSHP2和对照组中肝细胞癌干细胞频率。使用泊松分布统计数据和L-Calc软件程序(版本1.1)分析肝细胞癌干细胞的比例。将被慢病毒感染的细胞接种于NOD/SCID鼠(购自上海斯莱克实验动物有限公司，3～8周龄，许可证同BALB/c-nu裸鼠)皮下，注射细胞量为1 000～100 000，7周后评估肿瘤发生情况，处死并取出肿瘤，比较肿瘤大小。

2 结 果

2.1对照组和顺铂组裸鼠肿瘤体积、SHP2水平比较 随着饲养时间增加，对照组裸鼠肿瘤体积明显增加(F=30.964，P<0.001)，且明显高于同时间段顺铂组；而顺铂组肿瘤体积随着时间增加无明显变化(F=1.194，P=0.330)。比较2组裸鼠SHP2蛋白水平和mRNA的相对表达水平，结果显示，顺铂组SHP2蛋白水平和mRNA的相对表达水平均明显高于对照组，差异有统计学意义(P<0.001)，见表1、2。

表1 不同饲养时间对照组和顺铂组肿瘤体积比较

2.2空白组和索拉非尼组裸鼠SHP2水平比较 空白1组和空白2组SHP2蛋白水平和mRNA的相对表达水平均明显低于索拉非尼1组和索拉非尼2组，差异有统计学意义(P<0.001)。见表3。

表2 对照组和顺铂组SHP2蛋白水平和mRNA的相对表达水平比较

表3 对照组和索拉非尼组裸鼠SHP2蛋白水平和mRNA的相对表达水平比较

组别蛋白mRNA空白2组1.01±0.300.98±0.01索拉非尼2组2.16±0.432.54±0.40t6.2047.798P<0.001<0.001

2.3不同细胞株贴壁细胞和肝细胞癌干细胞中SHP2 mRNA的相对表达水平比较 在肝细胞癌细胞株SMMC-7721、LM3、HepG2和Huh7中，相较于贴壁细胞，肝细胞癌干细胞中SHP2 mRNA的相对表达水平明显增加，差异有统计学意义(P<0.001)。见表4。

表4 不同细胞株贴壁细胞和肝细胞癌干细胞中SHP2mRNA的相对表达水平比较

2.4SHP2对肝细胞癌干细胞扩增的影响 与RNA序列置乱的对照比较，shSHP2稳定转染的肝细胞癌细胞中球状体的比例降低，差异有统计学意义(P<0.01)，见表5。接种于NOD/SCID鼠后，相较于SMMC-7721对照组，SMMC-7721 shSHP2组致肿瘤数更少，但2组数据差异无统计学意义(P>0.05)，见表6。

表5 SMMC-7721和LM3细胞株球状体比例比较(%)

表6 不同细胞注射量SMMC-7721对照组和SMMC-7721shSHP2组在NOD/SCID鼠中的致肿瘤数(n/n)

3 讨 论

许多肝细胞癌患者就诊时即被诊断为晚期，错过了进行手术治疗的机会[13]。由于肝细胞癌的化学耐药性，包括肝动脉化疗栓塞术在内的常规化疗很大程度上对患者无效[14]。对于那些接受手术切除的患者，频繁的复发会导致生存期较差。因此，针对此类患者癌组织特异性指标变化的研究尤为重要，可用于临床早期疾病诊断。

本研究结果显示，随着时间的增加，给予治疗的顺铂组裸鼠的肿瘤体积未明显增加，而未给予顺铂的对照组肿瘤体积变化明显。处死裸鼠后，比较2组SHP2蛋白水平和mRNA的相对表达水平，结果显示，SHP2的表达在顺铂耐药的肝细胞癌癌组织中显著增加，这说明SHP2的表达与化学耐药性相关。为了验证这一结果，笔者取2例难治性肝细胞癌患者(索拉非尼耐药)病理组织标本建立移植瘤模型。比较2组裸鼠SHP2的表达发现，相较于对照组裸鼠，难治性肝细胞癌移植癌组织SHP2蛋白水平和mRNA的相对表达水平更高。因此，笔者推测SHP2表达与化学抗性或肝细胞癌复发相关。

肝细胞癌干细胞的存在被认为是肿瘤化学抗药性和肝细胞癌复发的起源[15]。因此，破译肝细胞癌干细胞调控的分子机制，是开发针对肝细胞癌干细胞新型治疗策略的热点和重点。考虑SHP2在难治性肝细胞癌中的异常表达和肝细胞癌干细胞在难治性肿瘤中的重要性，本研究用贴壁细胞作对照，比较其与肝细胞癌干细胞中SHP2 mRNA的相对表达水平。结果显示，肝细胞癌细胞株SMMC-7721、LM3、HepG2和Huh7的肝细胞癌干细胞中SHP2 mRNA的相对表达水平明显增加。为了验证这一结果，笔者构建shSHP2表达稳定肝细胞癌细胞株(SMMC-7721和LM3)，以RNA序列置乱为对照，比较肝细胞癌干细胞比例。结果显示，shSHP2稳定转染的肝细胞癌细胞中球状体的计数比例降低。接种于NOD/SCID鼠后，相较于SMMC-7721对照组，SMMC-7721 shSHP2组致肿瘤数更少。因此，shSHP2稳定转染的肝细胞癌细胞中干细胞的比例降低，说明SHP2耗竭降低了肝细胞癌干细胞的比例。尽管如此，SHP2在肝细胞癌干细胞中的作用仍不清楚，需要进一步研究讨论。