单端孢霉烯族毒素生物脱毒技术研究进展

朱晓慧，陆启荣，胡嗣祎，王 旭

(国家兽药残留基准实验室(华中农业大学)/农业部兽药残留检测重点实验室/农业部畜禽产品质量安全风险评估实验室/华中农业大学动物医学院，湖北武汉 430070)

单端孢霉烯族毒素是由多种霉菌产生的一类具有倍半萜结构的次级代谢物。产生该毒素的霉菌主要是镰刀菌属(Fusarium)。目前，已发现的单端孢霉烯族毒素有200多种[1]，根据化学结构不同，可将其分为A、B、C、D 4种类型，其均具有特征性的C-12，C-13-环氧环和相同的四环倍半萜结构，如图1所示。值得注意的是，在食品和饲料中污染最严重的是A型和B型的单端孢霉烯族毒素，其中T-2毒素是A型中污染范围最广、毒性最强的霉菌毒素之一；脱氧雪腐镰刀烯醇(DON)是B型中存在最普遍的霉菌毒素之一[2]，广泛存在于小麦、大麦、燕麦和玉米等粮食及含有小麦、玉米等的饲料中，给粮食生产和畜牧业带来了严重的危害。

图1 单端孢霉烯族毒素的基本结构

单端孢霉烯族毒素在我国乃至全世界的污染状况较为严重，不仅造成巨大的损失，对人和动物的健康也带来严重危害。T-2毒素对动物机体产生的毒性作用，主要体现在其能够抑制蛋白质、DNA和RNA的合成，引起细胞毒性和细胞周期阻滞，损害代谢旺盛的细胞组织器官[3-4]，并且依据暴露时间和剂量的差异，T-2毒素能够引起动物急性或慢性毒性。T-2毒素急性毒性会发生呕吐、腹泻、厌食、皮肤损害、胃肠炎、肠道出血、血细胞减少等症状[5]。动物摄入低剂量T-2毒素污染的饲料可导致生长抑制，免疫损伤[6]，血液系统紊乱、生殖和胚胎毒[7]，软骨损伤[8]等。DON又称呕吐毒素，是一种肠毒素，对猪最为敏感[9]。DON能诱导核糖毒性应激，破坏大分子合成、细胞信号传导、分化、增殖和死亡[10]，并能够影响包括神经内分泌信号的改变，促炎基因的诱导，生长激素轴的破坏和肠道完整性的改变[11]。急性DON中毒会引起动物呕吐，而长期低剂量暴露会引起动物厌食，生长迟缓[12]，免疫毒性以及由母体毒性导致的生殖和发育受损[13]，给畜禽生产带来严重危害和经济损失。

由于单端孢霉烯族毒素给畜禽养殖业带来了巨大的损失，霉菌毒素的脱除方法逐渐引起大家的关注。目前，脱除霉菌毒素的方法主要包括物理、化学和生物法3种。物理脱毒法主要有物理吸附(蒙脱石、硅藻土和沸石等)、辐照(γ射线辐照)、高温等；化学脱毒主要是使用碱法(氢氧化钠)和氧化法(次氯酸钠和臭氧等)来降低霉菌毒素的毒性；这些传统的物理化学方法在一定程度上是成功的，但也存在一定的弊端，如条件剧烈、安全性差、损害饲粮中的营养物质和风味等。生物脱毒主要是通过特异性筛选某种微生物或酶类，在其次级代谢产物或分泌的胞内、胞外酶的参与下，通过破坏、修饰或吸附霉菌毒素基团，从而达到减毒或产生无毒降解产物的目的[14-15]，能够对霉菌毒素进行脱毒的微生物主要有细菌、非产毒真菌和酵母菌。与物理化学法脱毒技术相比，生物脱毒具有条件温和、高效和特异性强，对原料和饲料的营养价值和风味影响小等优势[16]。因此，利用生物法脱除霉菌毒素已成为一研究热点，随着对霉菌毒素研究的不断深入，目前已经发现较多具有特异性降解真菌毒素能力的微生物。本文将从细菌、真菌、以及酵母菌角度对这几种微生物去除T-2毒素和DON毒性的作用进行综述，以期为相关研究提供参考价值。

1 细菌对霉菌毒素的降解

在微生物中能够降解单端孢霉烯族毒素的多数为细菌，且这些微生物主要来源于动物胃肠道和毒素存在的环境中。通过体外与毒素共培养的方式能够筛选出具有降解毒素的菌株，进而有效地将T-2毒素降解成毒性相对较低的HT-2毒素、T-2三醇、T-2四醇和镰刀菌烯三醇等或将DON降解成DOM-1、3-酮基-DON或无毒物质等。

1.1 细菌对T-2毒素的降解作用

目前在动物胃肠道中发现了几种单菌株能够有效的降解T-2毒素的毒性。Westlake K等[17]研究发现丁酸弧菌属菌株CE51和CE56可以将T-2毒素转化成为HT-2毒素、T-2三醇和NEO，而厌氧弧菌属解脂假丝酵母和反刍月形单孢菌只能将T-2毒素转化成HT-2毒素和 T-2 三醇。此外，有研究通过检查各种动物肠道和粪便对T-2毒素的代谢作用，发现来自大鼠、牛和猪的微生物可以完全将T-2毒素转化成蛇形菌素(DAS)；并发现从大鼠获得的肠道菌群能对DAS进行脱环氧环，生成脱氧15-单乙酰镰刀菌烯三醇(DE MAS)、脱氧镰刀菌烯三醇(DE SCP)和SCP[18]。此外，周浪花[19]等从新鲜健康的凡纳滨虾肠道中筛选得到T-2 降解菌株，其中蜡状芽孢杆菌和阴沟肠杆菌对 T-2毒素降解率最高，分别达到 91.8%和78.8%。上述研究表明，肠道内的某些细菌能够有效的降解T-2毒素，在今后的研究中可以从动物胃肠内分离筛选降解T-2毒素的微生物，既能有效降解T-2毒素，又能起到改善动物胃肠道菌群的作用。

除了在动物胃肠道中发现能够降解T-2毒素的细菌，在自然环境中也存在着部分能降解T-2毒素的细菌。施琦[20]等从虾养殖环境中分离得到5株镰孢菌，将它们作为试验菌种，在其产毒培养过程中分离到2株T-2毒素降解菌，16S rRNA鉴定结果分别为弯曲假单胞菌和尼泊尔葡萄球菌，对T-2毒素的降解率分别为90.9%和85.5%，其联合作用也有较好降毒效果。向雨珂[21]等也从土壤中分离出两种能够降解T-2毒素的细菌，分别是B14氧化微杆菌(M.oxydans)和B26暹逻芽孢杆菌(B.siamensis)，它们在18 h内均能脱除体系中95%以上的T-2毒素。Zou Z Y[22]等选用5株乳酸菌的发酵液探讨其对T-2毒素的脱除能力，发现植物乳杆菌102菌株(LP102)在37℃培养72 h后，其去除能力最强，该研究表明体外考虑菌株对毒素的脱毒作用时，需要综合考虑培养的温度以及时间等因素，以期能够达到最佳的脱除效果。上述的研究表明动物的胃肠道以及自然界中存在可以降解T-2毒素的细菌，但是并未对其具体的脱毒机制进行研究，值得进一步挖掘。此外，体外脱毒菌株的脱毒效率，应充分考虑培养的条件以及与相关细菌的联合协同作用，并对其降解的产物进行进一步的毒性评价及分析，为深入研究细菌的脱毒机制奠定基础。

1.2 细菌对呕吐毒素的降解作用

动物胃肠道中不仅存在降解T-2毒素的细菌，对于DON来说，也有部分细菌能够降解其毒性。研究最多的是从牛瘤胃液中分离得到的 BBSH 797菌株，其主要作用是能够将体内外的DON 转化成DOM-1[23]，这种细菌已经商业化，在市场上就能购买到含有BBSH 797饲料添加剂产品，但尚未应用到食品工业中。后续研究证明，菌株BBSH 797也能转化A型单端孢霉烯族毒素，其分泌的环氧化酶具有脱环氧作用，能够去除单端孢霉烯结构中的的12，13-环氧环，从而使单端孢霉烯解毒[24]。Yu H等[25]采用变性梯度凝胶方法从鸡肠道中分离了10株菌株，均能将DON转化为DOM-1。冯培生[26]等研究发现大鼠肠道中的微生物也可使DON转化为 DOM-1。上述研究表明，动物胃肠道中的细菌主要通过DON转化成DOM-1的方式来降低DON的毒性。

He W J[27]等人采用原位富集法从土壤中分离到具有脱环氧活性的一个菌群PGC-3，该菌群作用72 h开始降解DON，在168 h后能够完全降解DON。Wang Y[28]等筛选出一个能在5 d内有效降解近70 μg/mL DON的菌群C20，该菌群还具有降解15-乙酰-DON、3-乙酰-DON和T-2毒素的能力。He J W[29]从富含禾谷镰刀菌和霉变玉米的紫花苜蓿土壤中分离出来一种新型细菌Devosiamutans17-2-E-8，该细菌能够将DON转化为无毒的立体异构体3-epi-DON，且生物转化的条件是在有机氮和碳的来源下进行的，不需要DON作为唯一的碳源，这一过程本质上是酶促的，并且具有很高的解毒能力(3 μg DON/h/108细胞)。Wang S W[30]等从一个发霉的土壤样品中分离到一株地衣芽孢杆菌YB9，发现该菌株具有较强的脱毒能力，其能够明显抑制或减轻DON对小鼠的损伤，并改善DON引起的肠道菌群失调，可作为潜在的益生菌添加剂用于改善食品和饲料安全。Zhang J[31]等从渤海55 m深度海水样品中分离到ANSP101菌株，它能够通过氧化C-3羟基将DON转化为低毒性产物3-酮基-DON，降解活性主要归因于菌体裂解物。Zhai Y[32]等研究了一株产于酸奶中的副干酪乳杆菌LHZ-1菌株，发现DON与细菌细胞表面结合形成复合物，对50 μg/mL DON的去除率可达40.7%。计成[33]等筛选得到一株高效降解饲料中呕吐毒素的枯草芽孢杆菌(B.subtilis)ANSB471，经72 h反应后，该菌株对饲料中DON的降解率可达到95%，且经传代培养后，对呕吐毒素的降解率仍保持在90%左右，且该菌株还能够分泌酶活性较高的淀粉酶进而提高动物对饲料中淀粉的利用率。上述研究表明，在土壤或其他环境中存在高效降解DON的细菌，甚至能将DON转化成无毒的产物，但是具体的降解机制仍待进一步挖掘，有助于开发并改造新型高效的降解毒素的细菌。

2 真菌对霉菌毒素的降解

目前生物降解单端孢霉烯族毒素研究较多的真菌有木霉、青霉、曲霉等，相对于细菌脱除单端孢霉烯族毒素，筛选出能降解T-2毒素和DON的研究报道相对较少。

2.1 真菌对T-2毒素的降解作用

真菌对T-2毒素的毒性具有降解作用。吴娱[34]从土壤中分离筛选出一株能产生胞外酶降解T-2毒素的黑曲霉，提取的降解酶不仅可以降解T-2毒素且其降解率达到70%以上；并通过动物试验发现，在染毒饲料中添加1.5%的降解酶能显著降低T-2毒素毒性。汤飞[35]等筛选了一株降解T-2毒素的黑曲霉(Aspergillusniger)，将该菌株接种于含有不同质量浓度T-2毒素(10、20、50 μg/mL)的无机盐培养基中共培养，结果发现发酵7 d以及14 d后，其降解率分别在65%以上及90%以上，且从菌株中提取的降解酶对T-2毒素的降解率达到70%以上。上述研究均表明，真菌具有降解T-2毒素的巨大潜能，除了黑曲霉，仍有大量的真菌值得进一步挖掘并考察其是否具有更高效的降解能力。

2.2 真菌对呕吐毒素的降解作用

土壤中含有能够降解DON毒性的真菌。据报道，何成华[36]等自土壤中分离到一株可以生物转化DON的真菌塔宾曲霉H6(CCTCC NO:M2012128)，并获得了DON降解酶，该酶可水解DON结构C12-C13之间的环氧环。李亚菲[37]等从洛阳市周边采集的土壤样品中分离到了1株能降解呕吐毒素的菌株编号为Ma-1-4，具有较强降解DON的能力，对玉米秸秆中DON的降解率达46%，经形态学和分子生物学初步鉴定其分别为青霉菌属菌株。王开萍[38]利用苯基环氧乙烷作为唯一碳源，从土壤中分离到一株可以生物转化DON的菌株As-W6，经鉴定其为米曲霉，该菌株分泌的一种胞外酶可以生物转化DON。上述研究表明，土壤中可能存在大量的具有降解DON毒性的真菌，但是仍有大量的真菌有待发现，并对其降解机制有待进一步的挖掘。

3 酵母菌对霉菌毒素的降解

近年来不断有研究报道酵母细胞对霉菌毒素具有减毒甚至消除作用，酵母菌脱除毒素主要通过酵母细胞的细胞壁对毒素具有吸附作用，利用细胞壁上的β-葡聚糖等多糖、脂类和含有吸附中心的蛋白质，通过疏水作用力、氢键和离子键与霉菌毒素进行结合，且酵母细胞壁上的β-葡聚糖还可以将酚氧化酶体系活化，然后将饲料中的霉菌毒素进行分解，从而起到生物降解霉菌毒素的作用。因此，酵母菌作为解决谷类食品及动物饲料中的霉菌毒素的问题具有巨大的潜力。

3.1 酵母菌对T-2毒素的降解作用

酵母菌具有物理结合和生物转化的方式降解T-2毒素毒性的潜能。Zou Z Y[22]等选取了5株酵母菌株研究脱除T-2毒素的能力，结果表明在这5株菌株中酿酒酵母1221(SC1221)的脱毒能力最强，其在30 ℃培养96 h，其脱毒率能够达到36.50%±1.40%，进一步研究发现酿酒酵母主要是利用其细胞壁对T-2毒素的吸附作用，将丝状霉菌的有毒代谢产物结合到细胞壁上达到脱毒的作用，在此基础上，邹忠义[39]又将该酿酒酵母(SC1221)进行活化和培养，制成酵母菌培养液，喷洒于污染的粮食或饲料中，发现酵母菌培养液仍可有效去除T-2毒素，且去除率高。此外，Chlebicz[40]等研究了12株乳酸杆菌和6株酿酒酵母对饲料中常见霉菌毒素的脱毒作用，发现这些益生菌均能降解常见的霉菌毒素，其中对T-2毒素的脱除率为61%。

部分酵母菌可以通过生物转化的方式减少T-2毒素的毒性。Mccormick S P,等[41]测试了23种酵母菌株，通过研究发现，15种菌株能乙酰化将T-2毒素转化为 3-乙酰基T-2毒素(3-acetyl T-2 toxin)；3种菌株通过糖基化作用将T-2毒素转化为T-2毒素3-糖苷(T-2 toxin3-glucoside)；3种菌株通过移除异戊酰基形成新茄病镰刀菌烯醇(NEO)。虽然上述的研究表明酵母菌可通过物理吸附和生物转化的方式来降解T-2毒素的毒性，但是其具体的降解机制仍未阐述清楚，降解机制的进一步阐述有助于开发并挖掘更加高效的解毒途径。

3.2 酵母菌对呕吐毒素的降解作用

酵母菌可作为预防DON中毒的良方。Repedkiene J[42]等报道3种酵母菌分别为S.cerevisiaeS.1.5(T)、M.pulcherrimaM.1、K.marxianusK.7.1(T)可将面粉中 0.65 mg/kg DON 分别降低至0.10 mg/kg、0.12 mg/kg和0.05 mg/kg。Chlebicz[40]等发现DON是霉菌毒素中最具抵抗力的霉菌毒素，将6株酿酒酵母与DON孵育24 h后，DON浓度能减少22%～43%。

将益生菌酵母酿酒酵母I1079作为仔猪的预防策略。在动物试验中，将36只仔猪分2组，分别饲喂DON污染的饮食和受DON污染的酵母饮食，4周。结果发现补充酿酒酵母有助于提高仔猪对DON的抵抗力能力[43]，说明酿酒酵母能够脱除仔猪体内的DON。上述研究表明具有降解DON毒性的酵母菌具有开发成食品级的酵母菌，起到预防畜禽DON中毒的作用，并对食品的安全起到保驾护航的作用。

4 展望

国内外利用微生物脱除霉菌毒素研究了几十年，已取得了较大的成就，但能用于饲料生产的微生物的报道并不多，目前还是主要通过传统的物理和化学法脱毒。生物脱毒的高效安全使该方法具有成为降解粮食及饲料毒素污染的新星。综合大量研究，未来还需要从以下几个方面进行重点研究，以望生物脱毒技术能够完全用于粮食工业及饲料脱毒中。

(1)复合脱毒：对于食品和饲料中的单端孢霉烯族毒素，由于菌株对不同的毒素的敏感性不同，使用一种菌株降解毒素效果不理想。因此，通过多种脱毒方法结合完成毒素降解或能将够除去单端孢霉烯族毒素的菌株进行组合试验，使其发挥最大的降解率。

(2)使用益生菌降解：在自然环境中筛选出的野型菌株，虽然有降解效果，但可能会存在致病性，不能直接作为饲料添加剂添加于饲粮中。研究发现乳酸菌、芽孢杆菌、酿酒酵母等益生菌对单端孢霉烯族毒素具有较好的脱毒效果，可以将其添加在饲料中作为饲料添加剂，不仅能改善肠道，还能降解毒素。因此，在今后的研究中要重点开发脱除毒素效果好的益生菌，应用于饲料及粮食工业中来降低毒素浓度。

(3)诱变菌株：对于从自然环境和动物肠道筛选出的菌株来说，多数为新型菌株，虽能降解毒素，但会存在菌株降解效率低、降解酶产量低及其活性差等问题，因此，可以通过菌株诱变，筛选出能够高效降解毒素的菌株，特别是能筛选出同时降解T-2毒素和DON的菌株，是解决该问题的有效方法之一。

(4)酶基因的克隆及表达：对于筛选得到的降解T-2毒素和DON的微生物，从大部分研究来看，微生物降解毒素仅初步探索了其降解，对其机制并未达到深入的研究。从目前来看，能高效降解霉菌毒素的降解酶基因少之又少，今后还需要大量筛选具有降解能力的菌株，深入研究其机制，并分离纯化出微生物释放的降解酶，寻找调控该降解酶的基因，然后进行克隆，使其在表达载体中高效表达，从而运用到粮食和饲料工业的实际生产中。随着生物技术的不断发展，也可以将多个降解酶基因串联或融合在同一个表达载体中进行表达，使之能一次降解多种霉菌毒素。